高海拔适应与妊娠缺氧协同塑造啮齿类胎盘血管发育：跨物种趋同进化机制解析

本刊重磅推荐：这项开创性研究通过北美鹿鼠模型，首次揭示高海拔适应种群通过胎盘迷路区母体血腔扩张（增加气体交换表面积）和胎儿血管形态优化（提升单位面积交换效率）的协同机制，完美阐释了进化适应如何调控胎盘血管发育可塑性以对抗缺氧性胎儿生长受限（FGR）的生理学本质。该发现为人类妊娠高原疾病研究提供了跨物种比较范式。

　　

摘要

妊娠期缺氧（gestational hypoxia）会显著降低包括人类在内的哺乳动物胎儿生长速度和出生体重。而对高海拔缺氧环境的进化适应能够有效缓解这些负面影响，识别这些保护机制为了解环境因素如何与妊娠生理相互作用以影响健康结局提供了关键视角。胎盘作为介导母胎交换的核心器官，其发育过程虽已知受妊娠缺氧调节，但高海拔适应如何与这种发育可塑性相互作用以影响胎盘交换能力仍属未知。本研究利用北美鹿鼠（Peromyscus maniculatus）模型系统，检验了"胎盘交换表面的缺氧依赖性重塑对胎儿生长具有保护作用，因而在高海拔适应个体中会更为显著"的假说。

引言

高海拔居住与哺乳动物妊娠不良结局风险增加密切相关。对人类而言，这些不良结局包括先兆子痫（pre-eclampsia）和早产等妊娠并发症，二者共同导致高海拔居民新生儿出生体重下降的总体模式。其他哺乳动物在高原妊娠时同样经历高达30%的出生体重减少和繁殖失败率上升，表明高海拔妊娠挑战是哺乳动物繁殖的固有难题。

然而，并非所有种群对高海拔缺氧的胎儿生长负面影响 equally susceptible。经过进化时间尺度遗传适应高海拔的人类种群（如西藏和安第斯原住民）显示出显著减弱的高海拔缺氧对胎儿生长的影响。北美鹿鼠的高海拔居住种群也能在妊娠缺氧条件下相对保护胎儿生长。揭示这些生殖适应的生理机制对于理解环境因素如何与妊娠生理相互作用以决定生殖结局至关重要，这些发现可能最终为妊娠疾病干预或诊断措施提供新靶点。

胎盘是胎儿生长潜力的主要决定因素，很大程度上因为它促进妊娠父母与每个胎儿之间的气体（O₂和CO₂）、营养物质和废物产品的交换。这种交换能力通过胎盘中使母体和胎儿血液紧密贴邻的特殊结构实现。尽管这些交换表面的具体发育和结构在哺乳动物间存在差异，但交换区域内表面积的减少可通过限制交换能力来限制胎儿生长潜力。环境缺氧（无论是在高海拔还是实验室条件下）已被反复证明会促进胎盘大小和宏观组成的改变。然而，交换表面本身是否以及如何响应慢性妊娠缺氧而发育变化，包括母体和胎儿血腔的结构和密度，却很少被描述，且高海拔适应对这些过程的影响 largely unknown。

方法

伦理批准

所有动物工作均按照《实验室动物护理和使用指南》进行，并获蒙大拿大学机构动物护理和使用委员会批准（AUP 051-19）。研究确认动物程序符合《The Journal of Physiology》的伦理原则。

研究系统和样本收集

落基山脉高海拔鹿鼠种群相对于低海拔种群是衍生的。大量先前工作已记录了这些鹿鼠从基因组到整体生理水平的局部适应。本研究所用样本作为先前动物实验的一部分生成，所有实验鹿鼠均至少与野生捕获动物相隔两代。低海拔 ancestry 鹿鼠（BW strain）源自密歇根州安娜堡附近捕获的种群，高海拔 ancestry 鹿鼠则源自科罗拉多州Clear Creek县Mount Blue Sky顶峰（4300米海拔）捕获的 mice。

妊娠母鼠在怀孕第1天随机分配至低压缺氧或常压常氧条件。分配至低压缺氧的动物饲养在相当于4300米海拔的低压缺氧舱中（12.3% O₂）。常压常氧对照组在整个妊娠期饲养于同一房间的常压常氧条件下（18.3% O₂）。所有动物均饲养在Innovive静态一次性笼具中，垫料为Sani-Chip，整个适应期间自由获取食物（Teklad 8604）和水。

妊娠母鼠通过开放滴注异氟烷深度麻醉后断头处死。深度麻醉通过足部撤回反射和呼吸消失确认。全植入点在妊娠中期（相当于鹿鼠妊娠期18.5-19.5天，家鼠妊娠期15-16天）收集。

样本处理和免疫组化

冷冻植入点以胎盘大致垂直于刀片平面的方式包埋，然后以10μm厚度冷冻切片。在中线附近或中线处收集的切片解冻贴附于载玻片上进行免疫组化。切片用4%多聚甲醛固定，甲醇透化，并用PBS中的10%正常山羊血清封闭。切片与兔抗层粘连蛋白（laminin）一抗孵育过夜，随后与Alexafluor 568二抗孵育1小时。接着与FITC偶联的泛细胞角蛋白抗体（pan-cytokeratin antibody）孵育2小时，最后用DAPI显示细胞核。免疫标记的切片用Fluoromount-G封片，4°C保存直至在Olympus APX100荧光倒置显微镜上成像。

功能区和大型胎儿血腔的量化

为量化胎盘功能区域大小和大型胎儿血腔（即血管"主干"），每个植入点拍摄三张全切片4倍图像（图1A）。使用FIJI（v.2.14.0/1.54f）进行所有测量。全胎儿胎盘和迷路区面积使用自由手工具测量（图1A）。迷路区内胎儿血管树中的"主干"根据其大小识别（图1B）。它们的面积和周长测量同样使用自由手工具收集。数值使用每张图像中的比例尺从像素转换为微米。

迷路区组成和微血管血腔的量化

对于迷路区组成和单个血腔测量，每个植入点在三张切片上跨迷路区三个不同区域（一个中央和两侧各一个）拍摄三张40倍图像，总共每个植入点九张40倍图像。

对于迷路区组成测量，两名观察者使用IMOD（v.4.11.25）中的体视学功能量化360张迷路区40倍图像中胎儿血腔、母体血腔以及组织或细胞核团所占的百分比面积。设置十字线网格，方格间距110像素，每张40倍图像分配400个点。每个点分类为胎儿血腔、母体血腔、组织或细胞核团。每个空间所占百分比面积通过各类别点数除以总计数乘以100计算。

对于微血管血腔测量，两名观察者使用FIJI（v.2.14.0/1.54f）测量39个植入点中1906个血腔的面积和周长。在每个图像上随机偏移一个300,000像素2的网格。在该网格内，测量从左上角第一个完整方格开始的2×2区域。与四个方格区域右下边缘重叠的血腔全部测量，而与左上边缘（任何部分）重叠的血腔排除测量。重叠两个边缘的血腔排除测量。测量血腔时，选择绘图工具，沿血腔周长勾画轮廓。母体和胎儿血腔根据是否被细胞角蛋白（滋养层，仅母体空间）或层粘连蛋白（内皮细胞，仅胎儿空间）包围来区分（图1C）。面积和周长测量使用每张图像上的刻录信息（6.15像素/μm）从像素转换为微米。

统计分析

所有结果指标的统计分析在R 4.0.5中使用lme4()中的线性混合模型进行。所有模型包括随机效应以解释从单个植入点或母鼠收集的测量的非独立性。迷路区组成和微血管空间的线性混合模型还包括观察者的随机效应。所有统计模型采用广义形式：结果测量 ~ ancestry × 处理 + (1|随机效应)。为检查迷路区的相对大小，全胎儿胎盘面积作为协变量 included。类似地，为评估血腔周长的相对变化，血腔面积作为协变量 included。模型拟合通过performance::check_model()中的残差和影响点评估。主效应显著性使用lmerTest中的III型ANOVA（anova()）评估。图中的箱线图显示四分位数、范围和ggplot2()定义的异常值。图中显示的汇总变量仅用于展示，未用于分析。

结果

迷路区大小的 ancestry 和缺氧效应

研究首先证实，在环境缺氧下妊娠的高海拔 ancestry 小鼠比常氧下的高海拔 ancestry 小鼠或任一条件下的低海拔 ancestry 小鼠具有更大的迷路区（面积上；图1A）。然而，迷路区大小的增加与全胎盘面积成比例（图2B）。这些结果表明，在妊娠缺氧下观察到的 ancestry 个体迷路区更大是全胎盘生长增加的结果，而非迷路区的特异性扩张。

ancestry 和缺氧对胎儿血管"主干"的影响

接下来，研究检查了迷路区内大型胎儿血管空间（图1B）。在啮齿类中，胎盘迷路区的胎儿血腔由沿绒毛膜板的内卷形成，胎儿血管通过分支形态发生扩张并填充迷路区。在鹿鼠中，这些祖血管的"主干"延伸至迷路区全高，并且这些结构持续到妊娠晚期。

研究发现 ancestry 或妊娠缺氧对这些高阶胎儿血腔所占迷路区比例没有影响（ancestry: F_1,35.15 = 2.88, P = 0.098; hypoxia: F_1,35.26 = 2.72, P = 0.108）。单个高阶血腔的大小在 ancestry 或缺氧暴露间也没有变化（ancestry: F_1,35.39 = 1.12, P = 0.298; hypoxia: F_1,35.39 = 0.474, P = 0.496）。然而，高海拔 ancestry 个体这些大型胎儿血腔在全胎盘范围内具有更大的单位面积周长（ancestry效应: F_1,33.45 = 7.36, P = 0.010）。单个血腔也显示相同模式，即具有更大的单位面积周长（图3; ancestry效应: F_1,34.01 = 21.96, P < 0.001）。

ancestry 和缺氧对胎盘交换表面的影响

可能 functionally contribute to ancestry水平交换潜力差异（从而胎儿生长结局）的主要空间与迷路区的微血管相关（图1C）。研究接着询问 ancestry 和/或妊娠缺氧是否改变了迷路区的百分比组成。

研究发现高海拔 ancestry 个体 consistently 分配更大比例的迷路区给母体血腔（ancestry: F_1,32.86 = 4.67, P = 0.038; 图4B）。在妊娠期暴露于环境缺氧的母鼠中，母体血腔占据胎盘更大比例（hypoxia: F_1,32.86 = 4.39, P = 0.044）。相反，高海拔 ancestry 与分配给胎儿血腔的胎盘比例减少相关（ancestry: F_1,32.59 = 27.27, P < 0.001），并且这些空间对妊娠缺氧不敏感（hypoxia: F_1,32.60 = 1.00, P = 0.324; 图4C）。最后，研究发现暴露于环境缺氧的母鼠迷路区组织（ largely, 滋养层）约占减少5%（hypoxia: β = 4.79 ± 1.54%, F_1,32.0 = 9.76, P = 0.004; 图4A），但不因 ancestry 而异（ancestry: F_1,32.80 = 0.22, P = 0.645）。

为确定这些宏观组成变化如何与个体血腔的差异发育相关，研究接下来询问母体和胎儿血腔的大小或形状是否发生改变。母体血腔由周围组织（即滋养层组织）构建，因此滋养层在3D空间中组织方式的改变将对母体血液周围有效表面积具有决定性影响。

研究发现个体母体血腔在缺氧妊娠中面积更大（hypoxia: F_1,35.56 = 6.10, P = 0.018），但在高海拔和低海拔 ancestry 间无差异（ancestry: F_1,35.56 < 0.001, P = 0.999）（图5A）。缺氧相关的母体血腔面积增加与绝对血腔周长的边际增加相关（hypoxia: F_1,34.99 = 4.11, P = 0.051）。然而，母体血腔的相对周长（即单位面积周长）在 ancestry 或妊娠缺氧间无差异（ancestry: F_1,33.00 = 0.605, P = 0.442; hypoxia: F_1,33.13 = 3.14, P = 0.086）。

胎儿血腔面积响应妊娠缺氧而增加（hypoxia: F_1,31.18 = 6.46, P = 0.016）（图5B）。相反，来自高海拔 ancestry 动物的胎盘中的胎儿血腔面积通常更小（ancestry: F_1,31.20 = 11.04, P = 0.002）。这些面积变化与胎儿交换表面绝对大小变化一致：妊娠缺氧与胎儿血腔绝对周长增加相关（hypoxia: F_1,31.57 = 4.77, P = 0.0378），而 ancestry 与胎儿血腔绝对周长的边际减少相关（F_1,31.58 = 3.67, P = 0.065）。然而，高海拔 ancestry 胎盘在胎儿血腔中保留了更大的相对周长（即单位血腔面积周长）（ancestry: F_1,31.80 = 24.30, P < 0.001）。缺氧对胎儿血腔相对周长没有影响（hypoxia: F_1,31.40 = 1.33, P = 0.258）。

讨论

研究假设妊娠缺氧与迷路区母体和胎儿血腔的保护性扩张相关，这可能增加该器官的整体交换能力。因此 also 预测，在高海拔 ancestry 种群中观察到的胎儿生长保护与低海拔 ancestry 观察到的胎盘发育的缺氧依赖性变化的进一步扩张相关。结果支持了部分预测：环境缺氧和高海拔 ancestry 均导致胎盘中血腔和总血腔周长（表面积的代理）的增加。然而，这些 ancestry 依赖性差异由胎盘发育的 constitutive 差异解释，而非 ancestry 特异性对妊娠缺氧的敏感性。此外，研究发现高海拔 ancestry 与胎儿血腔形状改变相关，可能 further 增强交换效率。

先前研究表明妊娠缺氧与高海拔 ancestry 鹿鼠迷路区大小增加相关。本研究证明这种增加是环境缺氧和高海拔 ancestry 对胎盘发育的 aggregate 效应的结果。最终，这些独立效应意味着在缺氧下妊娠的高海拔 ancestry 小鼠在妊娠中期达到研究中任何组中最大的迷路区。大小增加应允许更大的总交换能力，因此全迷路区的扩张可能对胎儿生长潜力具有保护作用。高海拔适应鹿鼠 expand upon 在低地鼠中观察到的可塑性这一事实支持了这一观点；如果缺氧相关的迷路区扩张对胎儿生长 maladaptive，自然选择应 acted to blunt or eliminate 这种可塑性，而这并非观察到的。

观察到的迷路区大小增加似乎至少部分与母体血腔扩张相关。母体血腔面积（和周长）在低地和高地 ancestry 小鼠中均响应妊娠缺氧而增加，高海拔 ancestry 鹿鼠在妊娠缺氧下表现出最大的母体血腔。引人入胜的是，环境缺氧同样与具有低和高海拔 ancestry 个体的人类胎盘母体血腔扩张相关。鹿鼠和人类观察到的母体血腔重塑模式的一致性表明，母体血管空间交换表面的发育可能 across 胎盘哺乳动物表现出对环境缺氧的共同响应。这些共性也可能指向对胎儿生长潜力的共享适应价值。

研究还发现证据表明高海拔适应 ancestry 导致鹿鼠和人类胎儿血管发育模式的类似变化。具体而言，观察到来自高海拔 ancestry 鹿鼠胎盘的胎儿血腔在胎儿绒毛树的"主干"和"分支"中均显示更大的单位面积周长，并且这种模式对妊娠缺氧不敏感。美洲印第安人 ancestry 与安第斯妇女胎盘胎儿毛细血管管腔直径减少相关。在保留或扩张周长的同时减少胎儿毛细血管大小可能允许每单位流经那些胎儿毛细血管的体积有更大的交换表面积，从而 increasing 交换效率。确实，胎儿侧的这些组织变化可能是观察到的响应妊娠缺氧的母体血腔全盘扩张的重要对应部分。

这些微血管发育的相似性 arguably 更为 notable，因为人类和啮齿类在胎盘交换表面的发育上表现出一些重要差异。在人类的绒毛胎盘中，母体血腔的表面积很大程度上由被滋养层包围并形成母体血腔内"柱"的胎儿绒毛的发育和组织决定。因此，绒毛胎盘中母体血腔结构主要由这些含有胎儿血管的绒毛"柱"的组织和生长决定。相反，在啮齿类迷路胎盘中，滋养层形成组织母体血液的蜂窝状结构，胎儿血管通过其中发育。交换表面发育的这些根本差异（绒毛状 versus 迷路状）意味着人类和鹿鼠胎盘血管系统如何应对或进化响应缺氧的出现相似性不太可能反映发育约束 alone。

相反，研究预测滋养层和胎儿内皮细胞的保守生物学可能解释这些各自的过程。鹿鼠中缺氧相关的母体血腔增加与迷路区组织（ largely, 滋养层）减少幅度相似，这表明缺氧依赖性母体血腔变化最可能由滋养层增殖或组织的缺氧敏感性驱动。相反，ancestry 相关的母体血腔增加与 ancestry 相关的胎儿血腔减少幅度相似，这表明胎儿内皮细胞的发育和行为可能介导这些变化。

研究局限性

当前研究的一个主要限制是所关注的组织学技术无法直接说明交换能力的功能变化或后果。尽管发现与关于胎盘组织和微血管变化如何支持胎儿生长的假设一致，但交换能力和效率的直接测量需要额外实验。例如，微血流动力学量化可用于测量跨交换表面和通过胎盘的血流直接变化。此外，代谢示踪实验对于量化重塑对母体和胎儿循环系统之间营养物质实现交换的影响至关重要。最后，生成更完整或整体的胎盘血管树图像将有助于从单一视角对胎盘血管重塑进行多尺度理解。尽管如此，在实验背景下利用比较模型使用这些成本效益高的方法，能够提供证据表明胎盘交换表面的缺氧依赖性发育可塑性可能 broadly 具有保护性，基于这些响应在高海拔适应种群中增强的观察。此外，数据指向通过 novel 胎儿血管组织进一步增加胎盘交换效率的潜在趋同进化适应。这些观察从而为追求上述更密集和昂贵的功能技术提供了强有力的理由和方向。