日本脑炎病毒基因5型感染性克隆与报告系统的构建及其在抗病毒评价中的应用

本研究利用细菌人工染色体（BAC）系统成功构建了日本脑炎病毒基因5型（JEV5）的全长感染性cDNA克隆，并开发了携带纳米荧光素酶（NLuc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的报告病毒系统。该平台不仅实现了病毒复制的实时定量追踪，还为高通量抗病毒化合物筛选（如核苷类似物NITD008的EC50测定）提供了高效工具，对推动基因型特异性疫苗和抗病毒药物研发具有重要意义。

　　

1 引言

日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）是一种蚊媒黄病毒，是引起日本脑炎（Japanese Encephalitis, JE）的病原体，该疾病是一种炎症性神经系统疾病，主要影响亚洲和西太平洋地区的人类。在流行地区，日本脑炎主要影响15岁以下的儿童，但缺乏预先免疫力的任何年龄个体也可能发生与旅行相关的日本脑炎。JEV的传播通过涉及库蚊（Culex mosquitoes）和放大宿主（包括鹭科鸟类和猪）的地方性动物循环实现。然而，人类是终端宿主，因为病毒血症水平通常不足以促进向蚊媒的进一步传播。

JEV是黄病毒科（Flaviviridae）正黄病毒属（Orthoflavivirus）的成员，拥有约11 kb的单链正链RNA基因组，包裹在脂质包膜内。基因组包含一个开放阅读框（ORF），两侧为5'和3'非翻译区（UTRs）。ORF翻译成多蛋白前体，经过蛋白水解加工产生三种结构蛋白（衣壳蛋白C、前膜蛋白prM和包膜蛋白E）和七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。C蛋白形成高度有序的核衣壳，包装和保护病毒RNA基因组。该核衣壳被宿主衍生的脂质双层包围，其中包含两种包膜相关蛋白prM和E。prM蛋白在病毒颗粒组装过程中协助E蛋白的正确折叠和稳定，并在感染性颗粒成熟过程中被切割。E蛋白在成熟前在病毒表面形成同源二聚体，介导宿主细胞附着和膜融合，因此是病毒趋向性的主要决定因素和中和抗体的关键靶点。多蛋白的蛋白水解加工由宿主和病毒蛋白酶共同介导，其中NS2B-NS3复合物在产生病毒复制所需的功能蛋白中起核心作用。

基于E蛋白序列的分子系统发育分析将JEV分为五种基因型（JEV1-5）。JEV5以Muar株为代表，最初在马来西亚的一名脑炎患者中发现。早期的系统发育分析将Muar株分类为一个独特的JEV5谱系，随后的进化研究表明，JEV5可能代表最祖先的谱系，其他JEV基因型由此分化而来。随后的全基因组系统发育分析进一步支持了这一分类，表明JEV5是最接近共同祖先的基因型，JEV4、JEV3、JEV2和JEV1依次分化。由于JEV4和JEV5被认为是进化上的祖先基因型，最近的分离株主要由JEV3和JEV1组成。虽然JEV3在早期监测中普遍存在，但它在大多数流行地区逐渐被JEV1取代。最近，JEV5的检测增加引起了对其重新出现和潜在更广泛分布的担忧。越来越多的证据表明，JEV5在一些地区越来越普遍，突出了可能影响监测和疫苗效力的持续基因型转变。

尽管JEV被分类为单一血清型，但它包含五种不同的基因型（JEV1-5），对日本脑炎的控制和预防提出了重大挑战。值得注意的是，JEV5具有高致病性，在动物模型中引起早期病毒血症和中枢神经系统（CNS）侵袭。然而，其流行病学特征和全球分布仍然知之甚少。先前的研究表明，由基因型特异性JEV疫苗（如基于JEV3或JEV5的毒株）引发的中和抗体对异源基因型的交叉中和效力有限。因此，迫切需要评估现有JEV疫苗的保护广度，并通过进一步研究其免疫原性和交叉反应性，开发基因型特异性或广泛保护性的疫苗候选者。

与疫苗开发并行，发现有效的抗病毒化合物仍然是控制JEV感染的关键方法，特别是在流行地区。传统的抗病毒筛选方法，如空斑减少试验（PRA），长期以来一直用于通过量化感染细胞培养物中的空斑形成来评估候选化合物的抗病毒功效。尽管PRA因其在测量抗病毒活性方面的可靠性而被广泛使用，但它耗时、劳动密集，并且需要长时间的空斑形成孵育期。为了解决这些限制，现代方法已转向高通量筛选（HTS）平台，该平台利用经过基因工程改造以表达荧光或发光报告标记的报告病毒。这些技术允许快速自动量化病毒复制，从而显著加速抗病毒药物筛选过程。

在本研究中，我们使用细菌人工染色体（BAC）系统开发了基于cDNA的JEV5毒株（K15P38）感染性克隆，该毒株分离自韩国。该感染性克隆能够表征JEV5的遗传和表型特征，为了解复制动力学、细胞病变效应和致病潜力提供了见解。为了探索基因型相关的病毒行为差异，将JEV5克隆与先前开发的JEV3克隆直接比较，并使用小鼠模型系统评估了病毒学特性，包括空斑形态、生长动力学和神经毒力。此外，为了扩展我们JEV克隆的实用性，我们设计了报告病毒构建体，其中引入了纳米荧光素酶（NLuc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因。这些构建体旨在通过实现快速定量评估病毒复制来促进高通量抗病毒化合物筛选。我们的研究结果支持该报告病毒系统在抗病毒筛选和更广泛的病毒学研究中的适用性，突出了报告病毒系统作为进一步JEV研究的灵活高效平台的实用性。

2 材料与方法

2.1 细胞和病毒

非洲绿猴肾细胞系（Vero; CCL-81, ATCC）在补充有10 mM HEPES、1×抗生素-抗真菌剂和10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）中维持，于37°C、5% CO₂培养箱中培养。JEV5 K15P38毒株（GenBank: MK541529）从韩国疾病控制与预防机构（KDCA）获得。本研究中使用了先前报道的JEV3感染性克隆（JYJEV3）。JEV储备液和感染性克隆在Vero细胞上制备。

2.2 JEV5全长感染性cDNA克隆的产生

使用Ribospin vRD kit从JEV5储备液中提取病毒RNA，并使用TOPscript RT DryMIX dT18/dN6 plus进行cDNA合成。将JEV全长基因组分为九个片段，使用病毒特异性引物分别扩增。引物基于先前发布的K15P38序列设计，基因组的极端5'和3' UTR末端从其他JEV G5参考序列推断。每个片段克隆到pGEMT Easy载体中。使用In-Fusion Snap Assembly Master Mix kit，将九个片段组装成三个较大的片段，分别包含JEV5片段1（A+B+C）、片段2（D+E+F）和片段3（G+H+I）。随后使用In-Fusion协议将这三个大片段克隆到pBAC载体中。最终质粒包含在CMV启动子控制下的JEV5全长cDNA，并在3'端下游定位有丁型肝炎病毒核酶（HDVr）序列。

2.3 亲本和重组病毒的序列确认

为了确认亲本和重组病毒的身份和遗传稳定性，从多次传代收集的样品中提取病毒RNA。使用基于JEV5毒株K15P38设计的引物进行针对E、NS2A和NS5区域的PCR扩增。使用PmlI、BsiWI和AgeI对PCR产物进行限制性内切酶消化。此外，将扩增子克隆到pGEM-T Easy载体中，并通过Sanger测序进行分析。还对传代20的重组病毒进行了全基因组测序，以评估长期遗传稳定性。

2.4 基于pBAC-JYJEV5的报告病毒的构建

通过将包含5' UTR-C38、报告基因-2A和乱序衣壳-prME的报告基因盒插入pBAC-JYJEV5质粒载体中，产生表达报告基因的JEV5克隆。将该盒分为三个片段——5' UTR-C38、报告基因-2A和乱序衣壳-prME——使用所列引物通过PCR扩增。然后通过重叠PCR方法将这三个片段组装成一个盒。将所得盒插入用限制性内切酶PmeI和PmlI线性化的pBAC-JYJEV5质粒中。使用In-Fusion克隆方法将报告基因盒克隆到线性化质粒中。

2.5 pBAC-JYJEV5 cDNA克隆转染Vero细胞

包含JEV5全长cDNA的质粒pBAC-JYJEV5在大肠杆菌HST08 premium中扩增，并使用NucleoBond Xtra Maxi纯化。以相同方式制备和纯化报告基因构建体（pBAC-JYJEV5-NLuc和pBAC-JYJEV5-EGFP）。将Vero细胞接种在六孔板中，使用含有TransIT-LT1和6 μg质粒DNA（pBAC-JYJEV5或报告基因构建体）的1 mL Opti-MEM培养基制备转染混合物，孵育4小时。去除转染培养基，更换为2 mL生长培养基。

2.6 从细胞上清液中扩增和滴定亲本和重组病毒

将细胞培养上清液在Vero细胞中连续传代以扩增亲本和重组病毒（JYJEV5、JYJEV5-NLuc和JYJEV5-EGFP）。简而言之，用来自转染细胞的上清液接种Vero细胞，当约80%的细胞出现细胞病变效应（CPE）时收获。在所有病毒（包括亲本和重组病毒）感染的细胞中一致观察到CPE。收集的样品经过两次冻融循环，并在6000 g离心15分钟以获得无细胞上清液。对于后续传代，将澄清的上清液在新鲜培养基中稀释并用于接种新的Vero细胞。将收获的样品在-80°C储存用于进一步实验。

2.7 感染亲本和重组病毒的Vero细胞的免疫荧光分析

将Vero细胞接种在12孔板中，并用亲本或重组病毒感染。在感染后72小时（hpi），用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。固定后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，用0.25% Triton X-100透化10分钟，并在含有2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中于室温（RT）封闭1小时。将盖玻片与抗黄病毒E单克隆4G2抗体在含有2% BSA的PBS中稀释，于4°C孵育过夜。用PBS洗涤后，将盖玻片与Alexa fluor 488偶联的二抗在RT孵育2小时。用Hoechst 33258染色细胞核15分钟，用PBS洗涤并安装到显微镜载玻片上。

2.8 用于定量JYJEV5和报告病毒的空斑试验

进行空斑试验以定量亲本和重组病毒，详细信息见支持信息S1：支持方法。

2.9 亲本和重组病毒的冷冻电子显微镜（Cryo-EM）检查

通过冷冻电子显微镜检查亲本和重组病毒的形态，详细信息见支持信息S1：支持方法。

2.10 小鼠半数致死剂量（LD₅₀）的测定和神经毒力评估

用JYJEV3（0.1、1、10、10²和10³ PFU）和JYJEV5（1、10、10²、10³和10⁴ PFU）的系列剂量脑内接种8周龄雌性和雄性C57BL/6小鼠（每组n=5），或仅用PBS作为模拟感染对照。通过系列稀释将病毒储备液制备成所需浓度的PBS溶液。每天监测小鼠12天以评估体重变化。感染导致体重减轻和疾病表现，包括弓背姿势和毛发蓬乱。对表现出≥20%体重减轻或严重神经功能障碍迹象的小鼠使用CO₂窒息法实施安乐死，符合忠南大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南（批准号：202407A-CNU-116）。使用Finney概率分析法测定50% LD₅₀，并使用GraphPad Prism version 8.0分析存活数据。

2.11 小鼠免疫和攻毒

使用C57BL/6小鼠评估亲本和重组病毒（JYJEV3和JYJEV5）的免疫原性。将病毒储备液在PBS中稀释至适当浓度。该研究包括两个PBS对照组、两个JYJEV3组、两个JYJEV5组和一个亲本JEV5组。JYJEV3和JYJEV5组细分为两个亚组以评估交叉保护，产生四个实验亚组，而JEV5组作为JYJEV5的比较组。用1×10⁵ PFU的相应病毒剂量通过腹腔途径免疫8周龄雌性C57BL/6小鼠（每组n=4），间隔2周，共三次剂量。对照小鼠按照相同时间表和相同途径接受等体积的PBS。在第三次免疫后1周进行攻毒实验。用JYJEV3（250 PFU/20 μL）或JYJEV5（2000 PFU/20 μL）脑内攻毒小鼠，分别代表各自LD₅₀值的70倍。每天监测小鼠12天，观察体重减轻和神经症状，包括震颤、共济失调和轻瘫。

2.12 酶联免疫吸附试验（ELISA）定量免疫小鼠血清中的病毒特异性IgG

通过ELISA测定免疫小鼠血清中的病毒特异性IgG滴度，详细信息见支持信息S1：支持方法。

2.13 使用免疫小鼠血清进行血清中和（SN）试验

进行SN试验以测量病毒中和抗体滴度，如支持信息S1：支持方法中所述。

2.14 小鼠脑组织中病毒RNA、细胞因子和趋化因子表达的分析

通过定量RT-PCR（qRT-PCR）和Western blot分析JYJEV3或JYJEV5感染及对照小鼠的脑组织中的病毒RNA、细胞因子和趋化因子表达，如支持信息S1：支持方法中所述。

2.15 测定NITD008对重组病毒的EC₅₀值

将Vero细胞接种在24孔或黑色壁96孔板中，培养至80%–90%汇合度，然后用重组病毒（JYJEV3、JYJEV5、JYJEV5-NLuc和JYJEV5-EGFP）以0.1的感染复数（MOI）感染。在37°C孵育1小时后，去除接种物，并用PBS洗涤细胞两次。然后用维持培养基中的NITD008系列稀释液处理细胞。在感染后72小时（hpi），根据病毒类型评估病毒复制。对于JYJEV5-NLuc，使用Nano-Glo Luciferase Assay System测量细胞沉淀中的荧光素酶活性，并使用VICTOR Nivo微孔板读数器检测发光。对于JYJEV5-EGFP，使用同一读数器直接测量感染细胞中的荧光强度。对于野生型病毒（JYJEV3和JYJEV5），使用商业病毒RNA提取试剂盒从上清液中提取病毒RNA，然后进行cDNA合成。通过空斑试验测定病毒滴度，使用GraphPad Prism 8.0计算EC₅₀值。

2.16 统计分析

数据表示为平均值±标准差（SD）。使用SPSS软件（版本29）进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性。体外实验独立重复至少三次。对于两组之间的比较，使用未配对的双尾Student t检验。对于体内实验，使用Mann–Whitney U检验（非参数数据）、未配对双尾Student t检验、Tukey事后检验或对数秩（Mantel–Cox）检验进行组间比较（LD₅₀，每组n=5；免疫，每组n=4）。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 JEV5全长cDNA克隆的构建

从感染基因型5 JEV K15P38毒株的Vero细胞中提取病毒RNA，并用于产生九个RT-PCR片段（A–I），这些片段共同覆盖病毒的整个基因组。随后克隆并组装这些单个片段以构建JEV5的全长JEV cDNA。选择低拷贝数质粒（pBAC）进行克隆。产生了三个主要的JEV5片段，即片段1（A+B+C）、片段2（D+E+F）和片段3（G+H+I），使用In-Fusion克隆方法将每个片段插入pBAC载体中。最终组装的构建体在5'和3'端包含巨细胞病毒（CMV）启动子、丁型肝炎病毒核酶（HDVr）和牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化序列。通过琼脂糖凝胶电泳确认感染性克隆的成功组装。将完全组装的克隆命名为pBAC-JYJEV5。组装克隆与亲本病毒之间的序列比较显示，在克隆过程中无意获得了E基因中的两个沉默突变、一个错义突变、NS2B基因中的一个错义突变以及NS3和NS4B基因中各一个沉默突变。

为了评估组装克隆的感染性，将pBAC-JYJEV5转染到Vero细胞中。每天监测转染培养物的CPE，并与接种亲本病毒的细胞并行评估。感染性克隆转染的细胞从转染后5天开始出现CPE，而亲本病毒在感染后第4天开始诱导CPE。使用抗黄病毒E蛋白抗体通过共聚焦显微镜分析转染细胞中的病毒蛋白表达。在转染和感染的Vero细胞中从第3天开始观察到对应于病毒E蛋白的荧光信号。这些结果证实，将pBAC-JYJEV5转染到Vero细胞中产生了具有复制能力的JEV5颗粒，其表现出与亲本病毒相当的CPE和病毒蛋白表达。

3.2 亲本和重组JEV5细胞培养生长的比较

为了排除亲本病毒污染的可能性，通过引物设计在E、NS2A和NS5基因中引入了 distinct 点突变，以允许与亲本病毒区分。具体而言，工程化沉默突变以引入PmlI位点（GACGTG→CACGTG）、BsiWI位点突变（AGTGCG→CGTACG）和AgeI位点突变（TCCGGT→ACCGGT）。为了确认这些突变的存在，从亲本和重组病毒感染的细胞中分离的模板扩增了三个跨越特定区域的RT-PCR片段。这些片段包括一个845 bp的片段（跨越核苷酸477至1321，片段A）、一个618 bp的片段（跨越核苷酸3534至4151，片段B）和一个909 bp的片段（跨越核苷酸9486至10394，片段C）。用限制性内切酶消化来自重组病毒的RT-PCR产物，以确认成功引入沉默突变。PmlI切割片段A（557 nt和288 nt），BsiWI切割片段B（414 nt和204 nt），AgeI切割片段C（558 nt和351 nt）。这些结果证实了指定的沉默突变成功整合到工程化病毒基因组中。此外，传代20的病毒储备液的全长测序证实，整个基因组没有发生额外的突变或回复突变。在报告基因表达病毒的后期传代中，也观察到报告基因盒的预期缺失，这与由于选择压力导致的报告基因丢失一致。这些结果支持工程化克隆在连续传代过程中的遗传稳定性和功能性。

为了评估病毒复制，在Vero细胞中分析了亲本和重组病毒的生长动力学。亲本病毒在最初48 hpi期间表现出加速的复制动力学，而重组病毒显示出相似的模式但略有延迟。然而，两者在72 hpi时达到相当的最大滴度。对72至120 hpi病毒滴度的进一步分析表明，亲本和重组病毒都达到了相当的峰值滴度，加强了工程化克隆的遗传和表型稳定性。在感染后第5天进行的空斑试验显示，亲本和重组病毒之间的空斑大小或形态没有可辨别的差异。这些发现表明，重组病毒的感染性和复制动力学与亲本病毒非常相似。

3.3 通过冷冻电镜揭示的亲本和重组JEV5形态比较

为了进一步表征重组病毒，我们使用冷冻电镜分析了亲本和重组病毒颗粒的形态。未成熟病毒颗粒显示出不均匀的表面轮廓，并且直径比成熟的对应物大，后者表现出光滑的球形表面。两种病毒类型的平均直径约为50 nm。这些观察结果与典型的黄病毒形态一致，并证实重组病毒在病毒颗粒组装和成熟方面与亲本病毒没有显著差异。