靶向内质网重塑蛋白RTN3的吡啶并喹喔啉衍生物PS1097：一种抗ZIKV及其他正链RNA病毒的广谱抗病毒先导化合物

本文发现吡啶并喹喔啉衍生物PS1097能有效下调内质网蛋白Reticulon 3（RTN3），对Zika病毒（ZIKV）等多种依赖内质网重塑的病毒（如WNV、USUV、SARS-CoV-2、CVB5等）展现出纳摩尔级抑制活性（EC50 0.1–4.47 μM）和高选择性指数（SI）。其作用机制不同于Sofosbuvir（SOF），通过早期抑制病毒复制器官形成，且不易诱导耐药突变，为开发靶向宿主因子的广谱抗病毒药物提供了新策略。

　　

2 Materials and Methods

2.1 Chemical Compounds

研究使用的化合物包括吡啶并喹喔啉衍生物PS1097、PS1240、PS462（阴性对照）以及对照药物Ribavirin（RBV）和Sofosbuvir（SOF）。所有化合物以10 mM浓度溶于DMSO储存，工作浓度范围为100 μM至1.5 μM。

2.2 Cells

实验采用多种细胞系，包括人源肝细胞Huh-7、猴肾细胞Vero E6、Vero TMPRSS2、人神经微胶质细胞HMC3、人肺癌细胞A549、蚊源细胞C6/36以及犬肾细胞MDCK。细胞培养均使用含血清培养基，且定期检测支原体污染。

2.3 Viruses

研究涉及多种病毒，包括Zika病毒巴西株（ZIKV^Br）和乌干达株（ZIKV^Ug）、West Nile病毒（WNV）、Usutu病毒（USUV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、SARS-CoV-2（SARS-CoV-2^Mi）、柯萨奇病毒B5（CVB5）、水疱性口炎病毒（VSV）、重组疫苗病毒（VV-IND-G）、单纯疱疹病毒2型（HSV2）、流感A病毒（IAV）和托斯卡纳病毒（TOSV）。病毒均在许可细胞系上扩增并滴定。

2.4 Determination of Viral Yield Reduction and Effective Concentration 50%

采用病毒产量减少实验和空斑减少实验评估化合物抗病毒活性。细胞感染病毒后（MOI=5），加入系列稀释化合物，48小时后收集上清滴定病毒滴度（PFU/mL或TCID₅₀/mL）。通过非线性回归分析计算半数有效浓度（EC₅₀）。

2.5 Determination of Compound Cytotoxicity and Cytotoxic Concentration 50 (CC₅₀)

使用WST-8法检测化合物细胞毒性，计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）和选择性指数（SI = CC₅₀/EC₅₀）。SI≥10视为具抗病毒活性。

2.6 Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)

提取病毒RNA，通过qRT-PCR定量ZIKV NS1基因以及宿主基因RTN3、RTN4、FAM134B和GAPDH的mRNA水平，使用绝对定量标准曲线进行数据分析。

2.7 Western Blot Analysis

细胞裂解物经SDS-PAGE分离后转膜，用特异性抗体检测ZIKV NS5蛋白及内质网相关蛋白（RTN3、RTN4、FAM134B、TMEM41B），以GAPDH为内参。

2.8 Time-of-Addition (TOA) Experiments

在感染不同时间点（0–36小时）加入PS1097或SOF，48小时后检测细胞内病毒蛋白和RNA水平，分析化合物作用的时间窗口。

2.9 Selection of Viral Mutants

在逐渐增加PS1097浓度条件下连续传代ZIKV，试图筛选耐药突变株，评估化合物耐药屏障。

2.10 Synergism Between PS1097 and SOF

采用二维剂量矩阵评估PS1097与SOF的联合效应，通过SynergyFinder分析相互作用性质（协同、相加或拮抗）。

2.11 Graphics and Statistics

使用GraphPad Prism 7进行数据分析和作图，数据以均值±标准差或95%置信区间表示。

3 Results

3.1 Antiviral Activity Against ZIKV by a Selection of Compounds

从24个化合物中筛选出PS1097和PS1240对ZIKV^Br抑制活性最强，EC₅₀分别为0.69 μM和2.06 μM，SI分别为331.7和142.3。阳性对照SOF和RBV的EC₅₀分别为1.5 μM和8.8 μM。

3.2 Antiviral Activity of PS1097 on Different Viruses and Cell Lines

PS1097具有广谱抗病毒活性：对ZIKV^Ug、USUV、WNV的EC₅₀为0.86–1.29 μM；对SARS-CoV-2活性更高（EC₅₀=0.1 μM）；对CHIKV、CVB5、VV-IND-G也有抑制（EC₅₀=1.73–4.47 μM）；但对VSV、HSV2、IAV和TOSV无效。其在多种细胞系（Huh-7、Vero E6、C6/36等）均有效，但活性程度因细胞类型而异。

3.3 Determination of Viral Protein Synthesis During Treatment With PS1097

Western blot显示PS1097处理显著降低ZIKV NS5蛋白水平，且抑制病毒RNA释放。在Vero E6细胞中，SOF无效而PS1097仍有效，表明其作用机制不依赖细胞类型且与SOF不同。

3.4 TOA and Synergism Experiments

TOA实验表明PS1097在感染后12小时内添加均能有效抑制ZIKV复制，作用时间窗与SOF相似但机制不同。联合用药分析显示PS1097与SOF无协同效应，高浓度下甚至出现拮抗，提示二者可能通过不同途径发挥作用。

3.5 PS1097-Resistant Variants

经9周传代未能筛选出PS1097耐药株，病毒滴度逐渐下降至消失，表明PS1097具有高耐药屏障，其靶点可能为病毒复制所必需且不易突变。

3.6 PS1097 Causes Potent Downregulation of RTN3 Protein

机制研究发现PS1097特异性下调内质网蛋白RTN3（包括长短异构体），而对RTN4、FAM134B、TMEM41B表达无影响。qRT-PCR显示RTN3 mRNA水平下降约50%，但蛋白水平下降更为显著，表明存在转录后调控机制。

4 Discussion

PS1097作为一种吡啶并喹喔啉衍生物，通过下调内质网形态发生关键蛋白RTN3，破坏病毒复制器官（RO）形成，从而广谱抑制依赖内质网重塑的病毒（包括黄病毒、冠状病毒、肠道病毒等）。其作用机制不同于直接靶向病毒酶的SOF，具有高选择性、低细胞毒性和高耐药屏障优势。该研究为开发宿主靶向抗病毒药物提供了新思路，尤其针对新发再发病毒性疾病具有重要治疗潜力。