神经元源性细胞外囊泡通过AMPA/NMDA受体通路调控突触后电位振幅的机制研究

本研究揭示皮质神经元释放的细胞外囊泡（EVs）通过携带谷氨酸受体（AMPA/NMDA）及相关信号蛋白，显著增强受体神经元的自发性突触后电位（PSP）振幅。该发现为EVs介导的神经调控提供了新的分子机制见解，对理解突触可塑性和神经系统疾病具有重要价值。

　　

3 Results

3.1 Cortex-Derived Primary Cultures Display Active Synapses and Release Extracellular Vesicles

皮质源原代神经元培养模型经免疫荧光染色验证，包含72.37%±3.03%的神经元（NSE阳性）和27.63%±3.03%的星形胶质细胞（GFAP阳性）。该模型表现出成熟的神经元特征：微管相关蛋白2（MAP2）和F-actin共染色显示树突棘存在三类形态——丝状伪足、粗短型和蘑菇型 spines。突触前标记物synaptophysin与突触后标记物PSD95的共定位证实了功能性谷氨酸能突触的形成。

通过CD63-pHluorin荧光标记和时间推移TIRF显微镜技术，观察到神经元胞体和树突均存在多泡体（MVB）与质膜融合事件，证实了EVs的自发性释放。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示EVs平均粒径为155.6±18.87 nm，Western blot检测到CD81、Tsg101和Flotillin-1等EV标志蛋白，而高尔基体标志物GM130呈阴性。透射电镜图像呈现出典型的EV杯状结构。

3.2 The Proteomic Analysis of Cortical Culture-Derived EVs Reveals That They Are Carriers of Neuromodulatory Proteins

蛋白质组学分析鉴定出EVs与细胞裂解液共有2415种蛋白，其中26种为EVs特有。EVs样本间呈现高度相关性（Pearson相关系数>0.9），且富含Adam10、Apoe、Ezr等调控蛋白。基因本体（GO）分析显示EVs蛋白显著富集于神经元发育、增殖与分化过程。

关键发现包括：

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  EVs携带谷氨酸受体亚基GluA1、GluA2（AMPA受体）和GluN2b（NMDA受体）

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  互作蛋白网络包含CamkIIα和Gsk3β等信号分子

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  Reactome通路分析揭示AMPA/NMDA受体 trafficking 通路激活

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  免疫电镜证实GluA2亚基位于EVs脂质双分子层外叶

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  小鼠脑源EVs（BDEVs）Western blot验证了GluA1/GluA2/Nr2b的存在

3.3 EVs Derived From Cortical Cultures Modulate the Synaptic Activity of Recipient Hippocampal Cultures

将皮质神经元EVs与海马神经元共培养后，膜片钳记录显示：

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  自发放电频率无显著变化（p>0.05）

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  突触后电位（PSP）振幅显著增加（对照组4.517±0.7406 mV vs EVs组9.377±1.417 mV，p=0.0069）

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  AMPA/海人酸受体拮抗剂DNQX可完全抑制PSP，洗脱后活性恢复

  证实EVs通过谷氨酸能信号特异性增强突触后响应。

4 Discussion

本研究揭示了神经元EVs的多位点释放特性（胞体与树突）及其突触调控功能。EVs通过以下机制调控突触可塑性：

1. 1.

   膜整合机制：EVs携带的AMPA/NMDA受体可能通过网格蛋白依赖的内吞作用整合至受体神经元膜

2. 2.

   miRNA递送：神经元源性EVs可能通过miRNA调控兴奋性突触形成

3. 3.

   信号通路激活：TrkB受体激活可能介导突触密度调控

与胶质瘤源EVs增加Arp3蛋白水平的作用机制形成对比，神经元EVs更直接作用于谷氨酸受体系统。值得注意的是，GluN2b亚基的存在提示EVs可能参与神经元成熟调控。

5 Conclusion

皮质神经元释放的EVs具有典型形态特征（70-150 nm，杯状结构）和分子标志（CD81+/Tsg101+/Flotillin-1+），其蛋白质组富含突触相关蛋白。这些EVs通过增强谷氨酸受体功能，特异性提高受体神经元PSP振幅，揭示了细胞外囊泡作为神经调控新机制的重要作用。