综述：连接蛋白和泛连接蛋白半通道在神经炎症信号中的广谱作用

本综述系统阐述了连接蛋白（Cx）和泛连接蛋白（Panx）半通道作为神经炎症上游关键放大器的作用机制。文章详细解析了其在生理应激（如去极化、Ca2+超载、氧化还原改变或细胞因子暴露）下释放ATP、谷氨酸等危险信号，激活P2X/P2Y和NMDA受体，启动NLRP3炎症小体，并在多种急慢性神经疾病模型中促进病理传播。作者强调靶向这些半通道（如使用Gap19、D4、boldine等抑制剂）可显著改善病变、突触可塑性和认知功能，为新一代神经抗炎疗法提供了重要方向。

　　

1 引言

在中枢神经系统（CNS）中，神经元健康依赖于严格调控的神经-免疫串扰。大脑边界微环境中的肥大细胞、血管周围巨噬细胞和小胶质细胞持续执行监视功能。当边界控制失效时，保护性电路翻转，驱动突触功能障碍、神经元丢失和重塑，这在多种神经疾病中均有体现。大孔通道（孔径6–20 ?）在神经炎症中扮演核心角色，其可通透离子、ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）和代谢物。连接蛋白、泛连接蛋白、钙稳态调节蛋白（CALHMs）和富亮氨酸重复序列8（LRRC8）蛋白等家族独立进化，但均形成类似孔道。一旦开放，它们形成胞质至胞外的直接通路，需严格调控。持续激活会放大神经炎症、加剧兴奋毒性、扰乱损伤后的离子/氧化还原平衡，并加速退行性变。因此，大孔通道是极具吸引力的神经保护靶点。

本综述聚焦于连接蛋白和泛连接蛋白形成的半通道。文章概述了其结构和正常门控机制，详细阐述了应激源（去极化、氧化偏移、Ca²⁺超载）如何导致其持续开放，进而释放ATP、谷氨酸和损伤相关分子模式（DAMPs），激活胶质细胞，启动NLRP3炎症小体，并维持细胞因子循环。文章还调研了急性（如中风、创伤、癫痫发作和脓毒症）和慢性（如阿尔茨海默病和多发性硬化）模型，重点介绍了遗传、肽类和小分子方法，这些方法可抑制异常半通道活动并减轻脑炎症。

2 连接蛋白半通道

2.1 连接蛋白概述

半通道是连接蛋白亚基的六聚体组装体，形成间隙连接通道的一半，将细胞质与细胞外空间相连。人类表达21种连接蛋白，啮齿类表达20种。除连接蛋白23（Cx23）外，它们均在N末端（NT）、四个跨膜螺旋和两个胞外环上具有显著的序列同源性。首个原子结构Cx26通过X射线晶体学解析，冷冻电镜随后捕获了Cx31.3半通道的高分辨率结构。连接蛋白表达具有异质性：某些亚型（如Cx43）分布广泛，而其他亚型（如Cx46）仅限于特定组织。由于大多数细胞共表达多种连接蛋白，半通道可以是同聚或异聚的，从而产生巨大的组成多样性。

离子渗透和分子渗透可解耦并差异调控。缺乏宏观离子电流的疾病相关连接蛋白变体仍介导选择性、可饱和的小分子通量，具有竞争性抑制和微摩尔表观K_m值。NT域内的渗透物与孔道之间的相互作用调节这些动力学。结构建模将六个NT域置于胞质前庭，形成最窄通路。入口约5–8 ?的构象有利于离子流动但排除较大溶质；完全开放状态估计为12–15 ?，可容纳小分子。该模型假设NT重排和结合介导的分子逐步易位，可与经典离子传导状态分离。概念上，“离子和分子并不总是共同传输”捕捉了新兴共识：大孔通道可根据亚型、电压、二价阳离子和翻译后状态在通道样和转运蛋白样模式之间切换。

连接蛋白半通道门控受多种信号调节，包括膜电压、胞外二价阳离子、pH、膜拉伸和多种翻译后修饰（磷酸化、氨甲酰化、S-亚硝基化）。对于大多数连接蛋白，去极化和低[Ca²⁺/Mg²⁺]_o显著增强开放概率。升高胞外K⁺（使膜去极化）同样激活HeLa转染细胞中的Cx43半通道。由Cx46构成的半通道即使在浴液中无Ca²⁺/Mg²⁺时仍保持关闭，排除了简单的二价离子阻断作为门控机制。详细工作表明，Cx46的表观Ca²⁺敏感性随膜电位变负而增加，表明电压传感器运动与Ca²⁺结合之间存在变构相互作用。

对Mg²⁺的研究关注较少。迄今为止，仅Cx46半通道被证明在高[Mg²⁺]_o时关闭；其他亚型的可比研究仍缺乏。其他二价阳离子差异调节连接蛋白孔道：Sr²⁺抑制Cx43半通道依赖性染料摄取；Zn²⁺（与神经递质共释放）有效抑制培养水平细胞中的连接蛋白半通道。与其它二价阳离子相比，Zn²⁺效能排序为：Zn²⁺ > Cd²⁺≈Co²⁺ > Ca²⁺ > Ba²⁺ > Mg²⁺。Zn²⁺和Ca²⁺具有相加作用，Zn²⁺阻断需要胞外组氨酸。Zn²⁺也降低非洲爪蟾卵母细胞中表达的Cx26半通道电流；然而，有趣的是，1–10 μM Zn²⁺增强同一异源系统中的Cx35和Cx38半通道活性。镧系元素（La³⁺, Gd³⁺）是广谱、非选择性连接蛋白半通道阻断剂。因此，半通道对胞外金属的敏感性是亚型特异性的，反映了不同的结合位点和门控机制，仍有待完全绘制。

某些连接蛋白半通道作为化学传感器，其活性随胞外pH、氧化还原状态、NO和CO₂变化。碱化（pH ≥ 8.5）增加Cx43和Cx39半通道介导的电流和染料扩散，而Cx46半通道在pH≈6.4时迅速关闭。矛盾的是，CO₂驱动的酸化通过赖氨酸残基的氨甲酰化打开Cx26、Cx30和Cx32半通道。氧化线索和其他应激源（如H₂O₂或香烟烟雾提取物）也增强连接蛋白半通道的开放。NO供体促进Cx43中Cys-271的S-亚硝基化，增加半通道活性。Cx37和Cx40可能表现出类似的NO敏感性，而Cx26对NO不敏感，NO仅改变Cx46的电压依赖性。

两份报告显示，在脂质膜中重建的纯化连接蛋白半通道（无辅助蛋白）对Ca²⁺具有通透性，这一特性对神经炎症信号传导具有明显意义。低胞外Ca²⁺同样打开连接蛋白半通道，允许ATP外流。这首先在细胞培养中注意到，后来通过同时记录单通道电流和从单个星形胶质细胞局部ATP释放得到证实。许多提高细胞内Ca²⁺（[Ca²⁺]_i）的刺激汇聚于Cx43半通道激活。机械拉伸增强Cx43半通道依赖性染料摄取，直接[Ca²⁺]_i升高也是如此。一个合理的中间体是Piezo1机械敏感离子通道，它是一种拉伸激活的、Ca²⁺通透性通道，触发PI3K-Akt依赖性通路，导致Cx43半通道开放。在非色素睫状体和晶状体上皮中，拉伸激活瞬时受体电位香草素4（TRPV4）通道同样增强Cx43半通道活性，可能通过Ca²⁺依赖性胞质效应器而非直接连接蛋白结合。

蛋白质磷酸化调节连接蛋白半通道。在连接蛋白半通道被电生理表征之前，研究表明用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯激活蛋白激酶C（PKC）减少了推定的Cx43半通道介导的染料摄取。含有去磷酸化Cx43的重建脂质体对蔗糖高度通透；随后通过促分裂原活化蛋白（MAP）激酶磷酸化恢复了膜不通透性。直接电导测量后来证实ε-PKC强烈、βII/δ-PKC部分抑制Cx43半通道。相反，AKT磷酸化增加通过Cx43半通道的染料扩散，而PKC可能收缩半通道孔径。对于Cx43，PKC激活降低非洲爪蟾卵母细胞中Cx30半通道的电流和染料摄取。然而，突变单个丝氨酸/苏氨酸残基并不能消除调节，暗示多位点控制。

连接蛋白半通道的其他翻译后修饰已经出现。蛋白水解在晶状体发育过程中关闭截短的Cx46和Cx50半通道，但其更广泛的相关性仍然未知。一氧化碳（CO）也阻断半通道，可能通过PKG激活或直接连接蛋白羰基化。

胞外囊泡可在其表面展示连接蛋白半通道。生物信息学分析已在Cx43和Cx26中鉴定出几个RNA和DNA结合基序，暗示这些连接蛋白可能有助于将核酸货物加载到囊泡中。释放后，半通道的胞外环可与整合素或受体细胞上的兼容半通道相互作用。这种配体-受体配对引导囊泡到达特定靶标，并可能放大炎症信号传导。确实，Varela-Eirín及其同事证明，富含Cx43的小胞外囊泡触发软骨细胞、骨骼和滑膜细胞中的p53依赖性衰老程序。这驱动NF-κB和ERK1/2激活，升高衰老相关分泌表型——IL-1β、IL-6和基质金属蛋白酶（MMP）-1/-3——以及上皮-间质转化因子，从而将低度炎症和基质分解传播到邻近关节组织。

尽管间隙连接阻断剂关闭连接蛋白半通道——通过电流丢失、染料摄取或ATP释放证明——但更具选择性的抑制剂现已可用：小有机分子D4、模拟肽（如Gap19, ¹⁰panx1）、纳摩尔级、间隙连接保留小分子D4，以及多效生物碱boldine，所有这些都抑制癫痫样活动、神经变性和抑郁样行为。然而，关键差距仍然存在，例如慢性抑制的长期安全性，这仍然定义不清，但对于将这些“看门人”通道转化为下一代神经抗炎疗法至关重要。

2.2 连接蛋白半通道在脑炎症中的作用

连接蛋白半通道对脑炎症的贡献已在几篇先前的综述中强调。本节总结其作用的四条证据：(a) 炎症细胞表达哪些连接蛋白；(b) 促炎条件如何改变半通道活性；(c) 神经炎症反应期间开放半通道的直接证据；(d) 动物脑疾病模型中持续连接蛋白半通道开放的影响。

2.2.1 半通道阻断的治疗原理：CNS免疫和胶质细胞中的连接蛋白谱

炎症既是大多数病理的原因也是结果。尽管脑炎症在几乎每种脑疾病中都可检测到，但其在定义慢性疾病的 dysfunction 中的确切作用仍不清楚。因此，抗炎药物很少用于治疗抑郁症、精神分裂症或癫痫等疾病。几个因素可能解释这一差距。例如，患者之间的炎症强度差异很大。此外，当前的抗炎药物阻断单个细胞内通路，留下许多其他通路活跃。慢性治疗也必须持续，但残余通路仍然驱动表型转换和细胞死亡，逐渐建立组织 dysfunction 。而且，大多数药物缓解症状但仅适度有效。几十年来，治疗一直以神经元为目标，而胶质细胞关键作用的证据不断积累。因此，识别能够同时抑制多个炎症级联的上游分子靶点是一个紧迫的治疗优先事项，特别是那些存在于胶质细胞中的靶点。连接蛋白半通道满足这些标准，值得仔细研究。

如上所述，连接蛋白半通道在脑炎症研究中引起了相当大的兴趣。第一步是绘制协调炎症反应的细胞中的连接蛋白表达。例如，肥大细胞表达Cx32和Cx43，并且Cx43 clearly present on their plasma membrane。皮质刺伤后，小胶质细胞上调Cx43。当细胞用干扰素-γ加肿瘤坏死因子-α（TNF-α）共刺激或暴露于革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）时，小胶质细胞中的Cx43表达也上升。其表达也由革兰氏阳性来源的蛋白聚糖诱导。除了免疫细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞组成型表达多种连接蛋白；它们的模式和调控机制已被全面综述。

2.2.2 连接蛋白半通道、预处理和致命损伤

鉴于大脑的再生能力极小，了解连接蛋白半通道是否在致命损伤后介导细胞死亡至关重要。在达到危险阈值之前，亚致死损伤诱导细胞变化，赋予对后续严重损伤的保护，这种现象称为预处理。值得注意的是，Cx36和Cx43半通道参与缺氧或缺血预处理。值得注意的是，半通道甚至在线粒体内膜中发现 during preconditioning，其中Cx43似乎反对Ca²⁺诱导的 permeability transition-pore opening 并限制细胞死亡。线粒体Cx43的下调加重了脑缺血-再灌注后的线粒体 dysfunction 并扩大了梗死面积。

开创性研究表明，在“代谢抑制，称为化学缺血”（一种缺血-再灌注的体外模型）期间，Cx43半通道显著加速星形胶质细胞死亡。在这些条件下，星形胶质细胞膜迅速变得对溴化乙锭和Lucifer yellow通透，这在Cx43缺失的星形胶质细胞中不存在。代谢抑制在5分钟内提高质膜上的功能性半通道水平，这是一个Ca²⁺/AKT依赖性过程，可通过抑制囊泡-微管运输与Cx43模拟肽juxtamembrane 2（JM2）阻断。JM2同样被证明减少ATP释放并通过阻止质膜上Cx43水平的增加来抑制内皮炎症反应。

2.2.3 门控连接蛋白半通道的炎症介质和层级反应

开放的Cx43半通道有利于ATP外流，作为“危险”信号传播神经炎症。在这条分析线上，几种促炎剂已被证明能增强连接蛋白半通道介导的电流和染料扩散，包括NO、细胞因子、FGF-1、亚油酸和花生四烯酸、淀粉样β肽（Aβ）和乙醇。在大多数情况下，效应由氧化还原变化、[Ca²⁺]_i升高、分选至质膜或连接蛋白磷酸化介导。

长时间暴露于高亚油酸浓度可降低细胞活力，这种损失可通过Cx43半通道模拟肽TAT-Gap19预防，从而将过度的半通道开放与炎症损伤联系起来。星形胶质细胞 subjected to hypoxia reoxygenation 也出现类似关系：3小时 insult 导致血浆水平和Cx43半通道活性短暂升高而无细胞死亡，而6小时产生持续通道开放和显著细胞损失。当Cx43缺失或半通道被阻断时，两种效应均消失，通过染料摄取测量。将高葡萄糖添加到 otherwise mild 3小时方案中同样驱动持续半通道激活和细胞表面存在以及细胞毒性，表明联合炎症应激源 additive 作用。同样，暴露于Aβ的胶质细胞的条件培养基使神经元易受甚至亚致死3小时缺氧的影响，对于 which blocking Cx43 hemichannels 会保护用LPS加葡萄糖-氧剥夺挑战的星形胶质细胞。细胞类型研究揭示了敏感性层次结构：小胶质细胞反应最快，对最低Aβ浓度，其次是星形胶质细胞和神经元。Aβ也触发 rapid, hemichannel-dependent 肥大细胞脱粒，使肥大细胞成为 insult 的最早传感器。

肥大细胞释放的分子（例如，预形成的TNF-α和组胺）激活小胶质细胞，小胶质细胞上调谷氨酸合成并通过Cx32半通道释放大量谷氨酸。反应性小胶质细胞分泌的细胞因子刺激星形胶质细胞半通道活性。这种信号传导升级ATP和谷氨酸释放，并可能 other neurotoxic factors，驱动神经变性。这些发现 underscore connexin hemichannels as central amplifiers and, in some settings, initiators of neuroinflammatory spread。

2.2.4 急性与慢性炎症及脑损伤放大

每种细胞类型的重要性取决于 insult 是引发急性还是慢性炎症反应。在急性模型中，阻断 injury-induced 胶质连接蛋白半通道活性升高——通过增加的通道电流或染料摄取证明——保护神经元免受谷氨酸毒性、缺血-再灌注和脑内出血。鉴于肥大细胞被缺血-再灌注和许多其他 insults 激活，它们的连接蛋白半通道可能在急性神经炎症的发作中起关键作用。在慢性疾病如阿尔茨海默病（AD）中，海马和皮质区域的肥大细胞数量甚至在Aβ斑块出现之前就急剧上升，并且肥大细胞脱粒先于可检测的Aβ沉积。重要的是，连接蛋白-半通道阻断消除了该脱粒，如组胺释放试验所示。

诱导性、细胞特异性连接蛋白敲除（KO）阐明了人类疾病模型中谱系特异性贡献。在APPswe/PS1dE9小鼠（慢性AD样炎症的原型模型）中，在所有星形胶质细胞中观察到半通道活性，无论它们与斑块的距离如何。星形胶质细胞靶向删除Cx43降低了胶质递质释放并减轻了神经元损伤，而小胶质细胞特异性Cx43消融将小胶质细胞转向神经保护表型，增强斑块 engagement 并减缓疾病进展。

Thus far, we have mostly discussed disorders in which heightened hemichannel activity is a downstream consequence of the primary pathology. Yet, in several genetic conditions the opposite is true: Hyperactive connexin hemichannels appear to initiate or amplify brain inflammation. When the mutations affect connexins, they may generate gain-of-function hemichannels, further amplifying inflammatory signaling. For instance, Cx43 hemichannels are opened in a Niemann–Pick type C (NPC) model. NPC disease is a rare, inherited lysosomal-storage disorder caused by biallelic loss-of-function mutations in either NPC1 (~95% of cases) or NPC2 (~5%). NPC cells display heightened oxidative stress and [Ca²⁺]_i dysregulation. It is relevant to note that cortical astrocytes from NPC1-null mice display markedly elevated Cx43 hemichannel-mediated dye uptake. Conversely, in the cochlea, the Cx26^S17F mutant forms hyperactive hemichannels when co-assembled with wild-type Cx26, Cx30, or Cx43. The resulting Ca²⁺ overload kills HeLa transfectants and likely damages hair cells.

Propagation of brain inflammation proceeds by several routes, including the diffusion of proinflammatory molecules through interstitial fluids, intracellular spread exemplified by spreading depression, and the recruitment and proliferation of reactive cells. Diffusible messengers include oxygen- and nitrogen-derived free radicals and numerous cytokines. Reactive oxygen species (ROS) rise during neuroinflammation, and a reduced redox potential enhances connexin hemichannel opening. NO not only activates these pores, but also permeates them, hence facilitating cell-to-cell signaling transfer. In the absence of other large-pore channels, elevated extracellular K⁺ augments Cx43 hemichannel-mediated dye uptake, fueling the propagation of astrocytic spreading depression. Accordingly, blocking hemichannels under these conditions would preserve synaptic transmission. Once open, Cx43 hemichannel pores pass Ca²⁺ and ATP, driving Ca²⁺ waves that can trigger calpain-mediated death, and propagate injury among different cells, including microglia and neuronal progenitors. Persistent opening also releases “danger” ATP, depletes glutathione and NAD⁺, and may facilitate the exchange of inflammatory extracellular vesicles, amplifying degeneration in the peri-ischemic penumbra or hypoperfused cortex (e.g., epilepsy). Reactive cells enhance the cycle: Microglia after trauma and mast cells in AD models upregulate hemichannels within days to weeks, sustaining chronic damage.

Genetics highlights both gain- and loss-of-function extremes. As mentioned above, hyperactive hemichannels appear in NPC1-null astrocytes, while the deafness-linked Cx26S17F mutant forms toxic pores with Cx43/Cx30 in the cochlea. Conversely, Cx43 and Cx47 mutants in oculodentodigital dysplasia or Pelizaeus-Merzbacher-like disease abolish hemichannel function. However, these mutants also do not form functional gap junction channels, and dysfunction may occur via cell–cell disconnection rather than leak/overload through hemichannels. Together, these findings underscore connexin hemichannels as central amplifiers and, in some settings, initiators of neuroinflammatory spread.

3 泛连接蛋白半通道

3.1 泛连接蛋白概述

2000年，对间隙连接基因的全基因组调查揭示了三个与无脊椎动物innexins相关但与连接蛋白完全无关的脊椎动物序列。由于“innexin”不再捕获如此广泛的系统发育范围，这些蛋白质被重命名为pannexins（pan = “all”），并被提议形成不同于连接蛋白的脊椎动物间隙连接样通道。三个哺乳动物基因编码Pannexin-1（Panx1）、Pannexin-2（Panx2）和Pannexin-3（Panx3）。Panx1/2在海马、皮质、嗅球和小脑中丰富，而Panx3在皮肤中富集。异源Panx1形成快速激活的半通道，并且在细胞对接时，形成弱电压门控的细胞间通道；Panx2或Panx3 alone are silent，但Panx1 + Panx2共表达产生具有 novel properties 的异聚半通道。只有少数 later studies 证实了pannexin介导的染料或电耦合。在2010年代，广泛认为pannexins不能组装成间隙连接通道。最近的工作推翻了这一观点：表达内源性人Panx1（hPanx1）的少突胶质细胞形成真正的细胞间通道，表现出两种不同的电压门控模式。类似行为出现在缺乏Cx45的hPanx1-HeLa细胞中。Panx1免疫荧光是均匀的，而非斑块样，并且电镜未能揭示连接蛋白样晶体阵列，表明pannexin细胞-细胞通道作为稀疏、分散的导管运行。

所有三种亚型共享约50%氨基酸同一性和连接蛋白、innexins、CALHMs和LRRC8/体积调节阴离子通道的典型四个跨膜（TM1–TM4）支架。人Panx1（426 aa）、Panx2（677 aa）和Panx3（392 aa）的比对显示在N末端、四个螺旋和第一个胞外环上 strong conservation，但在胞质C末端（CTs）上 marked divergence：Panx1有一个短的酸性尾巴，包含一个caspase-3/7位点，Panx3的尾巴更短，而Panx2携带一个>250残基的、富含脯氨酸的 appendage。这些CT差异包括关键门控残基，并 underlie many functional distinctions。

冷冻电镜结构明确显示了2.8–3.2 ?的七聚体Panx1。~110 × 100 ?锥体胞外 capped 和胞质 flared。两个保守的二硫对（Cys66-Cys265, Cys84-Cys246）编织相邻的ECL1/ECL2环。七个Trp74残基形成最紧的缩窄（~9 ?），并与Arg75 + Asp81一起，创建一个芳香族-精氨酸-天冬氨酸三联体， favoring anions 并结合甘珀酸（CBX）。2023年人Panx2结构 confirmed sevenfold symmetry 但显示了 distinct gate：Trp74被Arg89取代，将孔道窄化至~6 ?。Panx3也组装为七聚体但具有最宽的孔道：25 ?胞质口逐渐变细至13 ?，然后在Ile74/Arg75形成的胞外领处为5 ?。

Like their connexin counterparts, pannexin hemichannels are permeable not only to classical ions but also to a striking range of signaling molecules, namely ATP, glutamate, lactate, spermidine, and even Ca²⁺ under certain conditions. Single-channel recordings reveal that Panx1 hemichannels do not behave as a pore with a single, fixed conductance. In intact mammalian cells, the channel most often resides in a low-conductance mode, exhibiting ~15 pS at negative voltages and rising to ~90 pS at positive voltages. Even in this “quiescent” configuration, brief excursions into higher subconductance levels can occur, and under permissive experimental conditions, the pore occasionally can reach a full-open state of roughly 500 pS. Reconstitution in lipid bilayers underscores this heterogeneity. Three channel populations have been resolved. The first is the 100 pS group that mirrors the low-conductance state seen in cells. The second is a cohort that spends most of its open time at ~190 pS, and the third is a transient population that appears immediately after the protein is inserted into the bilayer and flickers among substates before attaining a maximal conductance of ~400 pS. Together, these data argue that Panx1 hemichannels cycle through multiple conductive conformations rather than toggling between a single closed and open state, with the distribution of substates shaped by voltage, posttranslational modifications, and membrane environment.

Numerous stimuli can gate Panx1 hemichannels. Some trigger a reversible opening, others produce irreversible activation, and while some occur physiologically, others are used solely as experimental tools to elucidate channel properties. Early studies showed that higher shear stress in endothelial monolayers, negative pressure on membrane patches, direct cellular stretch, or hypo-osmotic swelling cultured cells all evoke rapid ion currents and dye permeation. These responses vanish when Panx1 is silenced or when classical blockers, such as CBX, are applied. Although a direct, stretch-gated mechanism for Panx1 hemichannels has not been ruled out, most data suggest the hemichannel itself is not the primary mechanosensor. Instead, mechanical cues appear to recruit upstream sensors—such as TRPV4 with downstream RhoA signaling, or Piezo channels that raise cytosolic Ca²⁺—which then activate Panx1 hemichannels. Consistent with the Piezo–Ca²⁺ model, mechanical stimulation triggers a focal Ca