骨组织内原位酶解联合LC-TIMS MS技术：骨病变蛋白质组学表征的高效新策略及其临床应用潜力

本文推荐一种创新的骨组织蛋白质组学分析方法——直接骨内胰蛋白酶消化结合液相色谱-捕集离子淌度质谱（LC-TIMS MS）技术。该方法无需复杂脱钙处理，可高效鉴定颅骨及下颌骨病理组织（如外生骨疣、骨瘤）与健康组织间的差异蛋白（如PEDF、SAP），实现87%的准确区分，为骨疾病分子机制研究和临床诊断提供强大工具。

ABSTRACT

骨组织常见病理变化（如骨瘤或外生骨疣）的分子机制因分析技术限制尚未完全阐明。本研究评估了直接骨内胰蛋白酶消化结合液相色谱分离与捕集离子淌度质谱（LC-TIMS MS）检测释放肽段的技术，在病理和健康骨组织中分别鉴定出6284和4810种蛋白质，数学分析实现87%的准确区分，表明该技术在骨组织表征中具有重要应用潜力。

1 Introduction

先进蛋白质组学技术为生理病理过程提供分子层面见解，但因骨组织不溶性特征，其在骨病变研究中的应用仍受限。外耳道（EAC）外生骨疣（俗称"冲浪耳"）与下颌骨外生骨疣作为良性骨增生病变，分别与环境刺激（冷水、寒风）及遗传-机械压力复合因素相关。骨瘤虽临床相似，但多为单侧发生且与遗传/炎症关联。二者均可导致耳道阻塞、传导性听力损失及下颌功能异常。蛋白质组学已揭示病变骨组织中细胞外基质蛋白和炎症介质的表达变化，但不同解剖部位（EAC与下颌骨）的分子差异机制仍需深入探究。

2 Materials and Methods

2.1 Chemicals

使用LC-MS级乙腈、三氟乙酸（TFA）、碳酸氢铵（NH₄HCO₃）和测序级胰蛋白酶（TPCK处理），所有样品经C₁₈ ZipTip纯化。

2.2 Human Bone Tissue Samples

样本来自Motol大学医院：14例病理颅骨组织（PATH组，含骨瘤/外生骨疣），9例健康颅骨对照（CTRL组，手术残留），6例健康下颌骨（MAND组，第三磨牙拔除残留）。所有样本获伦理批准，术前知情同意，-80°C保存。

2.3 Specific Cleavage of Proteins in Bone Samples

取4 mg骨组织，经异丙醇50°C预处理30分钟，碳酸氢铵溶液洗涤后，以20 μg/mL胰蛋白酶（50 mM NH₄HCO₃）37°C消化4小时（无需二硫键还原烷基化），释放肽段经ZipTip C₁₈纯化后干燥。

2.4 LC Separation and MS Detection of Released Peptides

采用nanoElute 2液相系统联用timsTOF HT质谱仪，DIA-PASEF模式采集数据（质量范围100–1700 m/z，离子淌度0.6–1.6 V·s/cm²）。数据已上传ProteomeXchange（标识符PXD065656）。

2.5 MS Raw Data Processing

MaxQuant（v2.6.4）进行标记自由定量，使用人类NCBI（GRCh38.p14）和UniProt（UP000005640）数据库，假阳性率（FDR）≤1%，唯一肽段定量，氧化和半胱氨酸断裂设为可变修饰。

2.6 Mathematical Analysis

采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以至少50%样本中出现且含两个唯一肽段的蛋白质进行建模，缺失值经NIPALS算法插补，通过留一交叉验证确定最佳潜变量数。

3 Results and Discussion

3.1 Direct In-Bone Protein Digestion With Subsequent LC-TIMS Separation and Identification of Released Specific Peptide Fragments

直接骨内消化-LC-TIMS技术成功鉴定健康颅骨组织4810种蛋白质、病理颅骨6284种、下颌骨3000种（表1）。 Venn图显示三组间独特及共享蛋白分布，总独特肽段达20,849个。该方法避免了传统脱钙步骤，显著提升检出效率。

3.2 Mathematical Analysis of the Obtained Data

PLS-DA分析显示：下颌骨与健康颅骨区分准确率93%（图3A），与病理颅骨达100%（图3B）；健康与病理颅骨区分准确率87%（图4A）；三组整体区分准确率86%（图4B）。结果表明不同解剖部位及病理状态存在显著蛋白质组差异。

3.3 Biological and Clinical Roles of the Selected Identified Proteins

病理与健康颅骨差异最显著的蛋白包括（表2）：

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  色素上皮衍生因子（PEDF，P36955）：上调1.98倍，调节成骨分化并提升骨量与塑性；

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  剪接体RNA解旋酶（DDX39B，Q13838）：下调0.95倍，可能通过免疫调节影响骨微环境；

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  血清淀粉样P成分（SAP，P02743）：下调1.67倍，与淀粉样沉积相关；

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  KCTD12（Q96CX2）：上调1.73倍，含BTB/POZ结构域，影响转录调控；

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  Cadherin 17（E7EN24）：上调1.08倍，可能参与骨形成信号通路。

4 Conclusions

直接骨内胰蛋白酶消化结合LC-TIMS MS技术可快速、高效鉴定骨病变组织蛋白质组，无需脱钙且操作简便，适于临床常规应用。虽可能比经典脱钙法检出蛋白数少，但未来通过优化（如纳入翻译后修饰分析）有望深化骨病理机制理解，并在颅底外科、口腔外科及古蛋白质组学中发挥重要作用。