假单胞菌PCDO介导苯甲酸(2R,3S)-2,3-二羟基-2,3-二氢苯甲酸盐的生物技术生产、分离与表征新策略

本刊推荐：本研究首次建立利用Pseudomonas citronellolis EB200来源的对异丙基苯甲酸2,3-双加氧酶(PCDO)高效生物转化苯甲酸生成(2R,3S)-2,3-二氢二羟基苯甲酸盐(2,3-DD)的创新方法，突破传统1,2-二羟基化路径限制，为手性合成提供高纯度（>95%）砌块，推动绿色生物催化在药物合成中的应用价值。

　　

引言

细菌Rieske非血红素铁加氧酶(RO)能够催化芳香化合物转化为邻位顺式二氢二醇，这类化合物在化学酶法合成药物、天然产物和聚合物中具有重要应用价值。对于苯甲酸而言，目前仅能通过酶法转化获得(1S,2R)-顺式-1,2-二羟基-2-氢苯甲酸盐，而其区域异构体顺式-2,3-二羟基-2,3-二氢苯甲酸(2,3-DD)或顺式-3,4-二羟基-3,4-二氢苯甲酸则难以获得。虽然早期研究曾通过对异丙基苯甲酸2,3-双加氧酶(PCDO)或氯苯双加氧酶与腈水解酶联用获得痕量2,3-DD，但这些方法均无法实现大规模生产。本研究开发了利用柠檬假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)EB200菌株的PCDO高效转化苯甲酸生成(2R,3S)-2,3-二羟基-2,3-二氢苯甲酸盐的创新方法，副产物形成可忽略不计，并建立了克级规模制备高纯度(>95%)2,3-DD钠盐一水合物的分离流程。

材料与方法

研究使用苯甲酸钠(Ph. Eur.级)及其他取代苯甲酸衍生物作为底物。通过从堆肥样品、土壤和污水处理厂活性污泥中接种矿物培养基(MM)进行菌株富集培养，培养基包含KH₂PO₄、Na₂HPO₄·2H₂O、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸铁铵和微量元素溶液。采用BOX PCR进行遗传指纹分析，16S rRNA基因测序进行菌株分类鉴定。HPLC分析使用C18色谱柱，甲醇:水:H₃PO₄=350:649:1流动相，210 nm检测。全基因组测序使用Illumina MiSeq系统，SPAdes软件组装，PGAP注释。

通过同源重组技术构建cmtB(2,3-二羟基-2,3-二氢对异丙基苯甲酸脱氢酶)和benA(苯甲酸1,2-双加氧酶大亚基)基因敲除突变体。将PCDO基因簇(cm tAa, cmtAb, cmtAc, cmtAd)克隆至pT7-5表达载体，在E. coli BL21(DE3)中表达。全细胞生物转化使用静息细胞在磷酸缓冲液(PB)中进行，添加苯甲酸和葡萄糖用于辅酶再生。

产物分离采用酸化(pH 2-2.5)后丁醇萃取，NaOH反萃取，乙醇沉淀获得钠盐结晶。使用700 MHz NMR、Orbitrap高分辨质谱、偏振光旋光仪和FT-IR光谱对产物进行全面表征。

结果

苯甲酸2,3-二羟基化菌株的富集与筛选

使用对位烷基取代苯甲酸(4-甲基苯甲酸、4-乙基苯甲酸和对异丙基苯甲酸)作为富集底物，成功分离16株纯菌。筛选发现仅有4-乙基苯甲酸和对异丙基苯甲酸降解菌能够转化苯甲酸生成2,3-二羟基化代谢物，而4-甲基苯甲酸降解菌则通过1,2-双加氧化路径代谢苯甲酸。EB200和EB600菌株即使在以苯甲酸为唯一碳源时也能分泌2,3-二羟基化代谢物，表明其p-异丙基苯甲酸降解操纵子可能为组成型表达或可被苯甲酸诱导。

柠檬假单胞菌EB200的鉴定

菌株EB200为革兰氏阴性、氧化酶和过氧化氢酶阳性细菌，最适生长温度25-40°C。全基因组比较和数字DNA-DNA杂交(dDDH=73.3)确认其为柠檬假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)。基因组分析显示EB200同时拥有经典的苯甲酸1,2-双加氧化路径和p-异丙基苯甲酸型2,3-双加氧化降解路径，还包含邻氨基苯甲酸、二萜类、苯乙酸等多种芳香化合物降解途径。

EB200敲除突变体的构建

葡萄糖预培养的EB200野生型静息细胞中仅部分苯甲酸转化为2,3-二羟基化代谢物。cmtB单敲除突变体中约50%消耗的苯甲酸积累为2,3-DD，而benA cmtB双敲除突变体能够将苯甲酸化学计量转化为2,3-DD，无副产物积累。生长实验证实苯甲酸和p-烷基化苯甲酸在EB200中通过独立路径降解。

EB200 ΔbenA ΔcmtB的2,3-DD生产

双敲除突变体静息细胞能够将苯甲酸定量转化为2,3-DD，但转化速率较低(最高147 μmol L^-1 h^-1 OD₅₄₆^-1)，且产物浓度达3 mM时活性急剧下降。添加4-乙基苯甲酸作为诱导剂反而降低转化速率。突变体呈现絮凝表型，不利于生物转化应用。

E. coli BL21(DE3)中的2,3-DD生产

将EB200来源的PCDO基因在E. coli BL21(DE3)中表达，IPTG诱导20小时(30°C)获得最高转化速率(315 μmol L^-1 h^-1 OD₅₄₆^-1)。自诱导培养基培养的细胞虽比活性较低，但细胞密度更高，且便于操作。细胞可回收使用多个工作日，最高转化速率超过450 μmol L^-1 h^-1 OD₅₄₆^-1，产物浓度达20 mM，脱氢生成2,3-二羟基苯甲酸的比例低于1%。

2,3-DD的分离纯化

丁醇萃取效率优于乙酸乙酯，最佳条件为pH 2、冰浴操作。通过NaOH反萃取和乙醇沉淀(水:乙醇=1:9)获得2,3-DD钠盐一水合物晶体，纯度85-90%(HPLC，以无水二氢二醇计)，总收率60-68%。NMR分析显示无有机杂质，晶体室温稳定数月。

2,3-DD的性质

X射线晶体学证实产物为(2R,3S)-2,3-二羟基-2,3-二氢苯甲酸盐。水溶液中性条件下稳定，酸性条件下加热迅速芳构化为3-羟基苯甲酸(95%)和2-羟基苯甲酸(5%)。pK_a值为4.3，滴定过程中芳构化损失小于1%。

讨论

本研究首次建立了高效生产2,3-DD的生物催化方法。不同于早期研究中PCDO对苯甲酸的微弱活性，EB200来源的PCDO表现出显著活性。基因组分析表明EB200并不通过2,3-二羟基化路径降解苯甲酸，2,3-DD的产生可能是p-异丙基苯甲酸降解酶系的副反应。

E. coli表达系统相比突变菌株具有更高转化速率和产物浓度，自诱导策略简化操作并降低成本。产物分离中丁醇作为绿色萃取剂展现优势。2,3-DD作为具有外环碳原子的手性砌块，在伪糖合成等领域具有应用潜力，也为细菌苯甲酸降解路径研究提供新工具。

本研究为手性顺式二氢二醇的高效生物制备提供了可靠方案，推动了绿色生物催化在有机合成中的应用进展。