克鲁兹蛋白酶催化Cys25质子化状态评估：恰加斯病治疗靶点的机制洞察与药物设计启示

本综述通过分子动力学（MD）模拟、自由能计算和显式溶剂恒定pH模拟，深入探究了恰加斯病关键靶点克鲁兹蛋白酶（Cruzain, Cz）催化残基Cys25的质子化状态。研究证实Cys25/His162催化二元体在游离酶及与底物（Ac-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-OCH3）或共价抑制剂（K777）结合状态下均保持中性，离子对（CysS?/HisH+）的形成可能是催化过程中的早期事件。该发现为理解半胱氨酸蛋白酶催化机制及理性药物设计提供了关键理论依据。

　　

1 引言

半胱氨酸蛋白酶作为人类多种疾病创新疗法的潜在靶点备受关注。许多病理状况与这些酶的功能失常相关，使其成为药物发现的重要目标。寄生虫和病毒来源的半胱氨酸蛋白酶更是治疗传染病的有效切入点。其中，克鲁兹蛋白酶（Cruzain, Cz）作为克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的主要半胱氨酸蛋白酶，在寄生虫体内外发育和生存中起关键作用，是治疗恰加斯病（Chagas disease）的重要靶点。这种被忽视的疾病在流行区和非流行区的影响日益显著，治愈和根除恰加斯病成为紧迫的医疗需求。

半胱氨酸蛋白酶的特征是拥有Cys/His催化二元体，通过亲核攻击底物肽键的羰基碳实现蛋白质水解。催化二元体有时也被称为催化三元体，包含额外的Asn残基，但该残基可能被水分子替代。关于半胱氨酸蛋白酶催化机制的一个关键问题是Cys/His离子对的形成时机：是在游离酶中预先形成（图1中的B路径），还是在配体/底物结合后形成（图1中的A路径）。

2 方法

2.1 系统设置

研究使用蛋白质数据库（PDB）代码6N3S的晶体结构作为Cz的初始坐标。除His162和Cys25外，所有残基的pKa值通过PDB2PQR服务器确定。采用Amber18软件包和ff14SB力场进行模拟，水分子使用TIP3P模型。每个系统在截断八面体单元中溶剂化，能量最小化后逐步加热至300K，并进行约束弛豫。

分子动力学模拟考虑了三个起始系统（图2），涵盖了Cz活性位点内与结晶水分子形成的不同氢键排列：起始点1中Cys25作为氢键受体和供体；起始点2中Cys25作为氢键供体和受体；起始点3中存在CysS^?/HisH⁺离子对。这些系统通过逐渐减少关键氢键距离的约束进行平衡，用于评估不同氢键模式的稳定性。

2.2 自由能景观

采用Bio3D包进行主成分分析（PCA），通过Cα原子的笛卡尔坐标计算位置协方差矩阵。自由能景观（FEL）分析使用前两个主成分（PC1和PC2），基于MD轨迹的概率分布计算吉布斯自由能。通过cpptraj模块生成FEL图并识别主要构象状态，同时计算每个残基的Cα原子波动和B因子。

2.3 分子对接和蛋白-配体复合物的MD模拟

从FEL中识别的五个最小值（A、B、C、D和E）用于进行Ac-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-OCH₃底物和K777抑制剂的非共价对接。对接协议使用Cz与K777结合的晶体结构（PDB ID 2OZ2）进行验证。对接结果显示底物与K777具有相似的结构排列，与实验观察一致。

对Cz-K777和Cz-底物复合物进行了五组300ns的重复模拟，总计3000ns的MD模拟。使用Amber18的ff14SB力场（蛋白质）、GAFF（配体）和TIP3P（水分子）参数集，采用RESP方法在HF/6-31G*水平计算抑制剂的优化结构和部分电荷。

2.4 显式溶剂中的恒定pH模拟

采用CpHMD方法预测Cys25和His162的有效pKa值。模拟在显式溶剂中进行，质子状态变化在GB隐式溶剂中尝试。CpHMD计算涵盖以下系统：水溶液中的Cys残基（肽段Gly-Ser-Cys-Trp-Ala）、配体游离的Cz、以及Cz与底物和K777的复合物。

考虑His162的两种质子化状态（中性和带正电），对每个系统进行八次重复模拟，每次在每个pH值下运行5ns。pH范围从0到14，通过运行平均去质子化分数计算pKa值，并使用修正的Hill方程拟合。

2.5 热力学积分

采用热力学积分（TI）计算pKa位移（ΔpKa）。TI计算包含11个窗口（λ值从0.0到1.0），每个窗口进行2ns MD模拟（1ns弛豫，1ns生产）。使用四个重复样本计算配体游离酶，八个重复样本计算复合物。同时采用最小距离分布函数（MDDF）方法表征蛋白质-溶剂相互作用。

3 结果与讨论

对配体游离Cz进行的300ns MD模拟分析了Cys25和His162三种不同质子化状态下活性位点的结构特征。骨架原子的均方根偏差（RMSD）证实蛋白质折叠的结构稳定性（RMSD值接近1?）。中性残基的Cys25硫原子（SG）与His162咪唑氮原子（ND1）的平均距离为3.43?，与游离X射线结构中的值（6N3S中为3.3?）一致。

Cys25巯基氢与ND1的平均距离接近2.7?，反映了有利于质子从Cys25转移到His162的构型。相比之下，具有Cys25^?/His162⁺离子对的游离酶中，S(Cys25)?Nδ(His162)距离缩短至3.08?。MD模拟表明His162和Cys25在游离酶中呈中性电荷。

PCA结果显示，游离Cz的主要构象变化与连接β2和β3链的环3、连接β5和β6链的环4以及连接β7和β8链的环6相关。起始点1的构象变化主要影响环3、环4和环6；起始点2主要影响环3和环6；起始点3主要影响环3和环4，环6影响较小。

B因子结果与PCA一致，显示起始点1、2和3中灵活性最高的区域主要位于环2（α2和α3之间）、环3（连接β2和β3）、环4（β5和β6之间）和环6（β8和β9之间）。实验B因子数据（PDB结构6N3S和6UX6）支持这些发现，表明模拟再现了这些柔性区域的动态行为。

通过MDDF方法分析活性位点水分子参与的氢键网络发现，全局蛋白质-水MDDF显示保守的水化层，尖锐的前两个峰（约1.8和2.8?）表明水-蛋白质氢键的有序排列。三个起始点的分布几乎重叠，表明无论初始构象状态如何，催化位点都趋向于保守的溶剂化结构。His162始终表现出更高的水分子配位倾向。

对溶质-溶剂MDDF的逐残基分解显示，Asp140、Asp161、His162和Cys25在埋藏的活性位点内表现出显著的水配位。Asn182、Ser183和Trp184靠近蛋白质表面，具有额外的溶剂暴露。这些结果表明，模拟开始时形成的水基网络在整个轨迹中持续存在，有效协调和稳定催化二元体。

对Cz与底物和K777复合物的MD模拟显示，Cz-K777和Cz-底物复合物在所有重复中均保持稳定（最小值E的底物复合物除外）。K777与Cz的结合通过与Asp161主链羰基氧的氢键相互作用得以稳定，平均距离约3.0?。Gly66通过氢键与K777的N3相互作用，同时与Gln19和Trp184形成额外接触，稳定抑制剂的磺酰基团。

Cys25硫原子（SG）与His162咪唑氮原子（ND1）的平均距离接近3.33?，比游离酶的平均值（3.43?）略短。在具有Cys25^?/His162⁺离子对的最小值E中，残基与抑制剂之间的距离相对一致，平均距离为3.09?，与游离酶中的距离（3.08?）匹配，表明抑制剂K777的存在不会显著改变Cys25和His162的几何排列。

对于Cz-底物复合物，底物骨架与Gln19、Gly66、Ser64、Asp161和Trp184残基在整个MD模拟中保持相互作用。Asp161与底物的相互作用最为频繁。Cys25硫原子（SG）与His162咪唑氮原子（ND1）的平均距离接近3.38?，略短于游离酶中的值。在底物复合物的最小值E中，底物-Cz相互作用发生变化，氢键平均距离更明显，某些氢键不稳定性表现为平均距离3.5?和标准差超过1.0?。

最小值E（初始包含离子对的系统）的结果显示底物在整个模拟过程中不稳定。RMSD分析表明复合物在模拟结束时RMSD值增加，由底物在模拟过程中的结构变化导致其退出活性位点。虽然Cys25和His162的排列在整个轨迹中保持稳定，但催化二元体与底物质心之间的距离在模拟结束时增加到12.0?以上，表明离子对系统不能为底物结合提供稳定性。

3.1 恒定pH模拟

CpHMD模拟显示，水溶液中Cys残基的pKa计算值为8.9，与实验估计值（8.6）一致。配体游离Cz中Cys25的平均pKa值为10.2，与实验值9.8一致。

与共价抑制剂K777和底物结合后，Cys25的pKa略微偏移至9.9和10.9。当His162质子化时，Cz-K777和Cz-底物复合物中Cys25的平均pKa值分别为10.1和11.9。这些结果支持在中性配体游离Cz、Cz-K777和Cz-底物复合物中存在中性Cys25-His162二元体的可能性。

3.2 估算pKa位移的自由能

TI计算显示，配体游离酶中Cys25从Cys25-SH转变为Cys25-S^?的自由能差（??G）为3.3kcal/mol，pKa位移为2.4，表明该转变不利，与Cys25在游离酶中质子化的实验数据一致。

存在配体和底物时，Cys25的自由能差分别为19.6和18.7kcal/mol，表明Cys25在Cz-配体复合物中也处于质子化形式。因此，中性Cys-SH/His二元体存在于Cz的预反应复合物中。未辅助的中性巯基对酰胺单元的亲核攻击涉及31kcal/mol的最高能垒，中性半胱氨酸巯基与巯基形式相比亲核性适中。

蛋白质环境显著影响某些残基的pKa值。在Cz中，His162的咪唑基团极化Cys25的SH基团，促进其去质子化和形成高度亲核的CysS^?/HisH⁺离子对。然而，中性状态（Cys和His残基均不带电）通常代表Cz酶的基态。在特定条件下，该中性状态转变为离子对（CysS^?/HisH⁺），作为反应路径上的关键中间体。这一观察与Zhai和Meek通过溶剂动力学同位素效应对Cz的研究结果一致。

4 结论

本研究深入探索了Cz催化残基Cys25的可能质子化状态。MD模拟显示Cys25与His162残基形成弱氢键，支持游离Cz中存在中性Cys25/His162二元体的观点。配体游离Cz中Cys25的计算pKa值为10.2，与实验值9.8一致。自由能计算表明催化Cys25/His162二元体在游离形式中呈中性，在与K777和底物的复合物中也呈中性。MD模拟提示中性Cys-SH/His二元体存在于Cz的预反应复合物中。因此，CysS^?/HisH⁺离子对的形成可能发生在Cys25亲核攻击之前，由局部电场变化触发。这些发现对药物设计项目具有重要意义，催化残基质子化状态的细节对对接和分子力学研究以及理解催化机制和抑制至关重要。