铜绿假单胞菌AsmA样蛋白YhdP和YdbH在维持外膜完整性中的结构与功能关系研究

本文聚焦于革兰氏阴性菌外膜（OM）生物合成机制，深入探讨了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中AsmA样蛋白家族成员YhdP和YdbH在维持外膜完整性中的关键作用。研究通过结构预测、分子动力学模拟和遗传互补实验，首次揭示YhdP C端疏水性α螺旋对其功能的核心重要性，并创新性地构建YdbH-YhdP融合蛋白，证明其功能增强且不依赖于OM伴侣蛋白YnbE。该研究为理解甘油磷脂（GPL）的跨周质转运机制提供了重要分子基础，对开发针对革兰氏阴性菌的新型抗菌策略（如破坏OM生物合成）具有重要指导意义。

　　

引言：革兰氏阴性菌外膜生物合成的挑战与机制

革兰氏阴性菌的细胞包膜由三部分组成：内膜（IM）、含有薄肽聚糖细胞壁的周质空间和外膜（OM）。其中，外膜是一种不对称双层结构，内膜小叶由甘油磷脂（GPL）构成，外膜小叶则由脂多糖（LPS）组成，同时还镶嵌着多种外膜蛋白（OMPs）和脂蛋白。这种独特的结构为细菌提供了机械强度，并能抵抗包括许多抗生素在内的大分子和/或疏水性有毒分子的侵袭，这也是革兰氏阴性病原菌固有耐药性的部分原因。因此，理解外膜的组成和生物合成过程不仅是微生物学的基础研究重点，也为识别新的药物靶点和开发新型抗菌剂提供了潜在方向。

外膜的组装需要多种疏水性分子跨越水性的周质空间进行运输，这一过程通过专门的蛋白质运输系统完成。例如，脂蛋白和OMPs分别由Lol和Bam系统转运并插入到外膜中，它们利用可溶性载体蛋白在周质中穿梭其底物。LPS则通过Lpt系统以连续流的形式运输到外膜，这是一个跨越周质的蛋白质复合物，连接了内膜和外膜。然而，数十年来，GPLs如何跨周质转运并插入到外膜（即GPL的顺向转运）的机制一直不明确。近年来的研究开始在^大肠杆菌（Escherichia coli）和^{铜绿假单胞菌}（Pseudomonas aeruginosa）中提供间接的遗传和生化证据，表明AsmA样蛋白家族的成员很可能参与了这一过程。

AsmA样蛋白的结构与功能特征

细菌的AsmA样蛋白的特征是有一个N端跨膜α螺旋（TMH），用于锚定在内膜上，以及一个大的可溶性结构域，该结构域预测可延伸至周质中，包含一个Chorein-N结构域和一个长度可变的AsmA样结构域。这些蛋白在结构上与真核生物蛋白（如Vps13和Atg2）相似，后者介导细胞器之间的脂质转移，这表明它们在膜间脂质运输中具有保守的作用。

AlphaFold的结构预测表明，AsmA样蛋白形成延伸的管状结构，由堆叠的β链组成，沿长轴形成一个连续的疏水凹槽。这种凹槽与周质中Lpt蛋白的β-果冻卷结构域形成的凹槽相似，后者在LPS从内膜到外膜的运输过程中容纳LPS，这支持了AsmA样蛋白可能作为GPL跨周质转运的蛋白质桥梁的假设。

虽然单个与GPL转运相关的AsmA样蛋白就足以支持细菌生长，表明它们功能冗余，但在^大肠杆菌和^{铜绿假单胞菌}中，YhdP的缺失会导致比其他AsmA样蛋白缺失更显著的外膜完整性缺陷。YhdP是唯一一个长度似乎足以跨越周质的AsmA样蛋白，分子动力学模拟表明其C端可能与外膜相互作用，从而支持其可能跨越整个包膜的特性。相比之下，其他AsmA样蛋白如TamB预测过于扭曲，而YdbH和PA4735则太短，无法跨越整个周质空间。因此，TamB需要与OM β-桶蛋白TamA相互作用，而YdbH的功能则需要OM脂蛋白YnbE，后者可延伸YdbH的连续疏水凹槽对其功能至关重要。

YhdP C端疏水α螺旋的功能重要性

本研究通过AlphaFold结构预测，发现在^{铜绿假单胞菌}YhdP的C端区域存在两个推定的α螺旋。这些α螺旋含有多个疏水残基，并被跨膜预测软件TMHMM 2.0预测为一个可能的跨膜螺旋（TMH），跨越残基1220–1239。类似的C端疏水区域在其他^{铜绿假单胞菌}AsmA样蛋白中并不存在，这表明这可能是YhdP的一个独特特征。

为了验证该C端区域对^{铜绿假单胞菌}YhdP蛋白的重要性，研究人员构建了两种YhdP变体：一种缺失整个C端区域（残基1220–1276），命名为YhdP-trunc；另一种仅缺失两个预测的α螺旋（残基1216–1241），命名为YhdPΔCHR（C端疏水残基）。结构预测表明，这些缺失不太可能破坏YhdP管状结构域的整体折叠。通过广泛的粗粒度分子动力学模拟评估它们的结构稳定性，确认它们保持了适当的折叠和结构域组织。评估指标包括：回转半径以监测全局紧密性和折叠一致性；天然接触分数以评估天然三级结构的保持；以及挫败水平作为折叠蛋白质中能量冲突的度量。所有指标均表明所研究的蛋白质在整个模拟过程中保持结构稳定。

这些YhdP变体在^{铜绿假单胞菌}条件突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^{ydbH rhaSR}-P_rhaBAD::^tamB ΔPA4735中表达。正如预期，外源表达野生型YhdP在无鼠李糖的情况下将条件突变体的生长恢复至野生型水平，证实YhdP单独就足以有效支持^{铜绿假单胞菌}生长。相比之下，YhdP-trunc的表达对条件突变体的生长曲线没有影响，而YhdPΔCHR的表达部分促进了条件突变体的生长，但未能达到野生型对照菌株的水平。

为了评估YhdPΔCHR在生理表达水平下的生长促进效果，研究人员比较了三重突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ydbH与携带突变^yhdP等位基因（用于表达YhdPΔCHR变体）的双重突变体Δ^tamB Δ^ydbH的生长曲线。表达YhdPΔCHR的双重突变体与缺失YhdP的三重突变体相比，生长改善微乎其微。此外，在缺乏TamB和YdbH的细胞中，YhdP的缺失或YhdPΔCHR的表达均导致对破坏膜的试剂（SDS和EDTA）或对具有完整外膜的革兰氏阴性菌活性较差的抗生素（万古霉素）极度敏感，表明YhdPΔCHR不能恢复缺乏必需AsmA样蛋白的细胞的外膜完整性。

总之，这些结果证明^{铜绿假单胞菌}YhdP的C端疏水α螺旋对其功能至关重要，这与先前在^大肠杆菌YhdP中的报道一致。

YhdP C端区域与YdbH的融合增强其活性

基于YhdP C端可能锚定在外膜和/或通过扰动内膜小叶来促进GPL插入的假设，研究人员探究了YhdP的C端结构域是否可以为其他AsmA样蛋白提供新的功能特性并可能增强其活性。为此，他们构建了两个载体：一个表达YdbH前808个残基（共855个）仅与YhdP C端结构域（残基1161–1276）融合，另一个与更长的YhdP C端区域（残基933–1276）融合，分别得到融合蛋白YdbH-YhdP_short和YdbH-YhdP_long。YdbH-YhdP_short和YdbH-YhdP_long的长度分别与YdbH或YhdP相当。选择YdbH进行融合蛋白构建是因为在其缺失时，对可能参与GPL转运的AsmA样蛋白中外膜完整性的影响最小，这表明它可能活性较低。

根据结构预测，YdbH的AsmA样结构域使得能够以保留异源β片之间连续性和维持疏水凹槽完整性的方式融合YhdP的目标区域。分子动力学模拟结果表明，两种融合蛋白预计不会发生解折叠或显著的稳定性和结构域组织改变。回转半径和天然接触分数在模拟时间内保持恒定。此外，具有最小挫败的残基数量远高于高度挫败的残基数量，表明杂交蛋白整体稳定。而且，融合点附近的残基被分类为最小或中性挫败。

为了验证它们的体内活性，在鼠李糖依赖性条件突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^{ydbH rhaSR}-P_rhaBAD::^tamB ΔPA4735中比较了生长动力学和万古霉素抗性（作为外膜完整性的代表指标），该突变体交替表达融合蛋白YdbH-YhdP_short或YdbH-YhdP_long，或从相同骨架质粒表达野生型蛋白YhdP或YdbH。结果显示，YdbH-YhdP_short在无鼠李糖时不能恢复生长，而YdbH-YhdP_long促进生长达到与野生型蛋白YhdP相当的水平。而且，YhdP和YdbH-YhdP_long在促进生长方面似乎比YdbH更有效，表明与YhdP C端结构域的融合增强了YdbH执行AsmA样蛋白必需功能（推测为GPLs至OM的转运）的能力。万古霉素最低抑菌浓度（MIC）测定证实了这一点，显示YdbH-YhdP_long的表达比野生型YdbH conferred 四倍更高的万古霉素抗性，尽管未能将抗性恢复至野生型菌株或表达YhdP的条件突变体的水平。

YdbH-YhdP_short缺乏功能互补与结构预测一致，即它不能跨越周质空间。然而，由于无法评估不同构建体的表达水平，不能排除体内表达或稳定性降低可能影响了这一结果。

为了进一步研究融合蛋白对外膜完整性的影响，将不同蛋白在三重突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ydbH中表达，并进行了N-苯基-1-萘胺（NPN）渗透性测定。NPN是一种疏水性探针，常用于测量外膜去稳定化，因为其与膜脂结合后荧光显著增强。使用该三重突变体进行测定是因为它含有PA4735基因，因此即使没有外源表达蛋白也能生长，从而可以相对于空质粒对照评估外膜完整性。YhdP和YdbH-YhdP_long的表达完全恢复了Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ydbH突变体的外膜完整性，因为NPN荧光与野生型菌株相当。尽管YdbH的表达相对于空质粒对照显著降低了NPN渗透性，但表达YdbH的细胞的外膜渗透性仍比表达YdbH-YhdP_long的细胞高约10倍。这一结果证实YdbH-YhdP_long在维持外膜完整性方面比野生型蛋白YdbH更有效。值得注意的是，在该测定中，表达YhdP或YdbH-YhdP_long的细胞之间未观察到显著差异，这与先前在条件突变体中万古霉素抗性的观察不同。这可能是由于三重突变体中存在PA4735，它可以补偿YdbH-YhdP_long相较于YhdP略低的活性。

与YhdP C端区域融合使YdbH不依赖于其蛋白伴侣YnbE

最近发现，OM脂蛋白YnbE是^大肠杆菌中YdbH活性所必需的，它通过与YdbH最后一个β链相互作用来扩展其疏水凹槽。研究人员假设将YdbH与YhdP的C端结构域融合可以使YdbH不依赖于YnbE行使功能。为了证明这一假设，首先验证了YnbE在^{铜绿假单胞菌}中是否对YdbH功能也至关重要。^{铜绿假单胞菌}PAO1的YnbE同源物由PA5306基因编码，与^ydbH（PA5307）相邻，并与^大肠杆菌YnbE有49.1%的同一性。因此，在双重突变体Δ^tamB Δ^yhdP中删除了PA5306，并将所得菌株（Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ynbE）的生长曲线与三重突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ydbH进行比较。如果^ynbE在^{铜绿假单胞菌}中对YdbH功能也至关重要，那么YnbE的缺失应该会像YdbH缺失一样损害生长和外膜完整性。正如预期，在缺乏TamB和YhdP的细胞中删除^ynbE导致明显的生长缺陷并增加了对SDS/EDTA和万古霉素的敏感性，提示存在显著的外膜去稳定化。然而，^ydbH缺失对生长和外膜完整性的影响比^ynbE缺失更严重，这引出了YdbH在YnbE缺陷细胞中可能保留某些残余活性的假设。值得注意的是，在野生型菌株中删除^ynbE不影响生长和OM功能。这意味着YnbE的功能是特定地在强烈依赖YdbH生长的细胞中所需的，正如先前在^大肠杆菌中观察到的那样。总之，这个初步实验证实YdbH在^{铜绿假单胞菌}中也需要YnbE才能发挥功能。

然后，在三重突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ynbE中外源表达融合蛋白YdbH-YhdP_long，以验证它是否也能在YnbE缺陷细胞中促进生长。YdbH-YhdP_long完全将Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ynbE细胞的生长恢复至野生型水平，表明该融合蛋白不需要YnbE来完成其必需功能。相比之下，在同一突变体中表达YdbH-YhdP_short未能促进生长，进一步表明该融合蛋白无活性。

值得注意的是，野生型YdbH的外源表达也未能支持突变体Δ^tamB Δ^yhdP Δ^ynbE的生长，该突变体已经从染色体基因表达了生理水平的YdbH。这一结果出乎意料，因为缺失实验表明YdbH在缺失YnbE时可能保留某些活性，这使研究人员假设YdbH过表达可能带来一些益处。YdbH过表达后缺乏任何生长促进效应可能可以通过除了YnbE之外还有其他OM伴侣的参与来解释，这些伴侣可能已经被染色体基因表达的YdbH水平所饱和。这一假设与结构预测一致，即YdbH–YnbE复合物仍然太短，无法桥接整个周质空间。目前，唯一一个已被识别出可能协助GPL插入OM的完整OM伴侣的AsmA样蛋白是TamB，它与Omp85家族的β-桶蛋白TamA相互作用。虽然TamB-TamA复合物最近被提议参与GPL插入OM，但它最初被涉及参与一部分OM β-桶蛋白的组装，其可能在蛋白质和/或GPL运输中的双重作用仍有争议。研究人员先前已经表明^tamA缺失对^{铜绿假单胞菌}生长没有影响，提示TamA并非所有必需AsmA样蛋白的活性所必需。然而，这一证据并不排除TamA可能对YdbH功能有贡献，因为YdbH失活本身对生长和OM完整性的影响可忽略不计。为了最终确定TamA是否有助于YdbH介导的GPL插入，研究人员在三重突变体Δ^tamA Δ^yhdP Δ^ydbH中外源表达了YdbH，并以融合蛋白YdbH-YhdP_long作为对照，该突变体缺乏TamA，并且由于TamB同时失活以及YhdP和YdbH的缺失而表现出严重受损的生长。值得注意的是，即使在没有TamA的情况下，YdbH的表达也完全恢复了突变体的生长，使用YdbH-YhdP_long也得到了相同的结果。这样的结果排除了TamA是YdbH功能所必需的，因此，它可能不是YhdP-YnbE复合物的额外组成部分。

YhdP及与YhdP C端区域融合的YdbH在异源宿主中的功能

研究数据表明，将YdbH与YhdP的C端区域融合可以绕过对YdbH蛋白伴侣的需求，并增强该蛋白促进生长和支持外膜生物合成的能力。基于分子动力学模拟，Cooper等人提出^大肠杆菌YhdP的C端疏水螺旋插入OM的周质小叶。然而，这些螺旋是否可以通过扰动GPL小叶的连续性来促进GPL插入膜中，或者这个过程是否需要尚未识别的YhdP OM伴侣，仍不清楚。

研究人员认为，通过检查蛋白质在异源宿主中的行为可以获得解决这个问题的初步见解。事实上，来自^大肠杆菌和^{铜绿假单胞菌}的YhdP同源物氨基酸同一性非常低，在包括疏水C端区域在内的最后90个残基中只有26.7%的同一性。这表明推定的相互作用残基保守性差，因此，^{铜绿假单胞菌}蛋白与^大肠杆菌中潜在的非天然伴侣之间可能只有微弱或低效的相互作用。因此，研究人员在本研究调查的所有^{铜绿假单胞菌}蛋白变体在^大肠杆菌突变体Δ^tamB Δ^yhdP中外源表达，该突变体以生长受损和对万古霉素超敏为特征，提示存在外膜完整性缺陷。有趣的是， both ^{铜绿假单胞菌} YhdP 和融合蛋白 YdbH-YhdP_long 将生长和万古霉素抗性恢复至（几乎）野生型水平，而所有其他蛋白质没有显示任何挽救效应。^{铜绿假单胞菌} YdbH 不能互补^大肠杆菌突变体可以归因于与^大肠杆菌 YdbH 伴侣的低效相互作用，因为YdbH同源物同源性也非常低（仅在蛋白的六分之一上有24.4%的同一性），或者是因为Δ^tamB Δ^yhdP细胞表达了内源的YdbH蛋白，它可能饱和了YnbE，从而使^{铜绿假单胞菌}同源物失活。无论哪种方式，这些结果进一步证实YhdP的C端区域赋予了YdbH新的功能，包括在异源宿主^大肠杆菌中工作的能力。虽然这种种间互补实验支持YhdP C端区域可能具有允许OM相互作用和GPL插入的内在特性的假设，但这仍有待通过生化和生物物理分析来证实。

结论与展望

本研究证明了^{铜绿假单胞菌}YhdP的C端疏水α螺旋对其维持外膜完整性的功能至关重要，可能是通过实现膜相互作用和/或促进GPL插入。这与最近在^大肠杆菌同源物中的报道一致，表明YhdP的这一结构和功能特征在不同物种间可能是保守的。此外，研究发现