不对称四聚体抗体：体外和体内高效激动促红细胞生成素受体（EPOR）的新型激动剂

本文报道了一种新型不对称四聚体抗体（Tb-Fc2），其通过独特表位高效激活促红细胞生成素受体（EPOR），在体外和体内均展现出优于传统重组促红细胞生成素（rEPO）的活性。该研究揭示了多价抗体激活受体的分子机制，为开发更安全、长效的促红细胞生成刺激剂（ESA）提供了新策略，有望规避EPO多效性相关的肿瘤和心血管风险。

　　

1 引言

促红细胞生成素（EPO）是一种多效性细胞因子，通过结合促红细胞生成素受体（EPOR）二聚体调控红细胞生成。传统重组EPO（rEPO）及其衍生物（如达依泊汀）虽广泛应用于贫血治疗，但存在半衰期短、需频繁给药以及通过异源二聚化激活非造血通路（如EPHB4或β-CR/CD131）导致肿瘤风险和心血管副作用等问题。抗体药物因其高特异性、长半衰期和低免疫源性成为理想替代品，但既往研究的二价抗体（如IgG、scFv-Fc、Db-Fc）均因空间构象限制无法有效诱导EPOR二聚化激活信号。

2 结果

2.1 噬菌体展示Db库构建

研究团队通过改造人源scFv框架，引入Gly₅ linker构建了V_L-V_H串联的 diabody（Db）噬菌体展示库。库容量达4.2×10⁹，通过定向多样化重链CDR（H1、H2、H3）和轻链CDR-L3，获得多样性良好的抗体序列。

2.2 EPOR激动剂筛选

经过5轮筛选，获得26个结合人EPOR的独特克隆。其中14个Db-Fc融合蛋白能结合TF-1细胞（表达内源性EPOR），但仅7个（Db-Fc 1-7）可诱导细胞增殖，且这些活性克隆均不结合小鼠EPOR（mEPOR），提示表位物种特异性。Db-Fc 1和2活性最强，被选为后续优化模板。

2.3 先导激动剂表征

Db-Fc 1和2以纳摩尔级亲和力结合EPOR（EC₅₀分别为1.5 nM和0.6 nM），且不结合EPHB4或CD131。竞争实验表明它们与EPO结合表位重叠。在UT-7/Epo细胞（EPOR依赖性细胞系）中，二者诱导增殖的效力（EC₅₀=0.2-0.4 nM）甚至优于EPO（EC₅₀=1.1 nM），并激活JAK2、STAT3/5、ERK和AKT磷酸化，信号模式与EPO相似。

2.4 优化EPOR激动剂

SEC分析发现Db-Fc主要呈二聚体，但存在少量高分子量寡聚体（推测为四聚体Tb-Fc₂）。通过软随机化突变CDR，获得单分散性改善的变体1.1（>99% Db-Fc），但亲和力降至5.0 nM。进一步优化得变体1.2，恢复高亲和力（K_D=1.8 nM）并保持单分散性。

2.5 寡聚化对激动活性的影响

变体1.3呈现多聚体"阶梯"（Db-Fc、Tb-Fc₂和六聚体Hb-Fc₃）。制备SEC分离各组分后，细胞实验证明：二聚体Db-Fc几乎无活性（EC₅₀=16 nM），而Tb-Fc₂（EC₅₀=2.0 nM）和Hb-Fc₃（EC₅₀=1.1 nM）活性与未分馏混合物相当甚至更优，且无EPO特有的"钩效应"（高浓度抑制），表明多价结合是激动关键。

2.6 体内EPOR激动活性评估

在人源化EPOR小鼠模型中，注射未分馏Db-Fc混合物（含多聚体）可显著提升血细胞比容，且持续时间长达2个月，优于达依泊汀。药代动力学显示血清半衰期达4-10天。纯化二聚体组分则无活性，证实体内活性依赖高阶寡聚体。

2.7 不对称四聚体晶体结构

去除Fc的V_L-V_H 1.1仍保留结合和激动活性，但体内半衰期缩短。晶体结构（2.06 ?）显示不对称单元含4条链，形成两个Db，再通过非常规V_L/V_L和V_H/V_H界面组装成不对称四聚体（Tb），4个结合位点间距59-68 ?，均可结合EPOR。该结构不同于既往对称Tb模型，极性相互作用主导寡聚化。

2.8 Fab:EPOR复合物晶体结构

Fab 1.1:EPOR复合物结构（2.1 ?）显示结合表位位于EPOR domain 1，与EPO site 1仅部分重叠（3个共同残基），但与其他激动抗体DA5和ABT007表位不同。结合由疏水/极性网络介导，重链贡献63.2%界面。与人EPOR相比，鼠EPOR的D61G、P63S、W64R、L66S突变导致结合丧失，解释物种特异性。

2.9 不对称Tb激动EPOR的模型

结构建模表明，Tb通过位点1和2招募EPOR二聚体，其C端间距（32 ?）与EPO诱导的活性二聚体（37 ?）近乎一致，可模拟天然激活构象。高斯荧光素酶蛋白片段互补 assay（PCA）证实Tb诱导的EPOR胞内区接近度与EPO相当甚至更优。四价性允许第三EPOR结合，可能增强信号稳定性。

3 讨论

本研究首次揭示不对称四聚体抗体作为EPOR高效激动剂的机制。其通过非EPO表位实现多价结合，精准诱导受体不对称二聚化，规避异源二聚化风险。相比传统ESA，Tb-Fc₂具备更强效力、效价和持久性，且无钩效应。尽管生产挑战（活性组分占比低）仍需解决，但通过界面工程和链接子优化有望实现临床转化。该策略为开发其他聚类依赖型受体激动剂提供了范本。

4 方法

研究采用噬菌体展示筛选、哺乳细胞表达蛋白、SEC分析寡聚态、BLI测定亲和力、细胞增殖 assay、免疫印迹、晶体学解析结构、Gluc PCA检测受体 proximity、以及人源化EPOR小鼠模型验证体内药效和药代动力学。