噬菌体与夫西地酸在离体犬皮肤模型中对耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌的协同作用研究

本研究首次在离体犬皮肤模型中证实了特异性噬菌体vB_SpsS_LmqsKl44-4与夫西地酸（FA）对耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌（MRSP）的协同杀菌效应。通过改良盐裂技术构建的Franz扩散细胞模型显示，联合治疗8小时可使MRSP菌落数显著降低（p<0.05），为治疗犬MRSP脓皮症提供了新型局部联合治疗方案，对应对多重耐药菌感染和推动抗生素精准管理（AMS）具有重要意义。

　　

引言

随着耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌（MRSP）在犬科患者中流行率的持续上升，这不仅对动物健康构成威胁，更因其人畜共患潜力成为公共卫生隐患。欧洲食品安全局（EFSA）将其列为犬猫三大最相关耐药菌之一，流行率约达30%。耐药性加剧因素包括生物膜形成，它可进一步降低抗菌疗效。在21世纪，抗生素管理（AMS）至关重要，迫切需要细菌感染治疗的新多模式方法。

伪中间型葡萄球菌是犬皮肤感染最常见病原体，占病例≤92%，尤其在浅表脓皮症中。深部脓皮症虽较少见，但可能引发血源性传播和全身性菌血症。尽管全身性抗菌剂疗效证据有限，96.5%诊断为细菌性脓皮症的犬仍接受全身和/或局部抗菌治疗。有良好证据表明，单用局部治疗对浅表脓皮症（包括MRSP病例）有效。先前研究显示，夫西地酸（FA）对MRSP具有高效性且皮肤渗透性良好。

烈性或专性裂解性噬菌体（phages）是普遍存在的病毒，可感染特定细菌宿主并在其中复制，导致细菌裂解。它们具有高度宿主特异性，与抗菌药物不同，不改变周围微生物组。噬菌体可单独使用或与抗菌剂联合应用。对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的治疗已显示协同效应。假设认为，与单药治疗相比，使用两种不同作用模式的药物时，细菌产生抗菌耐药性的可能性较低。因此，通过多模式方法可能保留抗菌药物未来疗效。近年来，伪中间型葡萄球菌特异性噬菌体已被分离并在体外进一步表征。

材料与方法

MRSP菌株5463/1/22源自作者小型动物医院犬只伤口。根据临床和实验室标准研究所（CLSI Vet01）进行分离、培养和药敏试验。使用调整0.5麦氏浊度（相当于1×10⁷菌落形成单位，cfu）进行实验。

通过CLSI文件Vet01第5版确定常见测试抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。根据药敏试验结果，该分离株对苯唑西林耐药，因此归类为MRSP。PCR分析确认存在mecA基因。通过制备夫西地酸钠盐（Sigma-Aldrich Chemie GmbH）储备溶液确定FA的MIC。基于这些结果，选择400μg FA在离体真皮模型中局部处理MRSP分离株。

本研究使用的噬菌体vB_SpsS_LmqsKl44-4（LmqsKl44-4）从作者小型动物医院水槽排水管分离。简要而言，将拭子样本转移至SM缓冲液，过滤后使用软琼脂覆盖技术进行噬菌体分离。通过连续挑选和培养单个噬斑进行纯化，随后使用软琼脂覆盖方法扩增噬菌体LmqsKl44-4。

如先前所述对噬菌体LmqsKl44-4进行负染。样品使用TEM 910显微镜（Zeiss）在80kV加速电压下检查，配备慢扫描CCD相机。使用操作软件ITEM测量头径和尾长，使用Excel计算平均尺寸。

六只代表主要处于休止期毛囊周期的品种犬，因与本研究无关的目的被安乐死（主人知情同意捐赠）。排除标准包括之前72小时内接受全身抗菌治疗和/或之前4周内接受全身糖皮质激素治疗，以及临床皮肤改变犬只。在安乐死后24小时内采集皮肤样本。在侧胸部位剪毛并切除皮肤，去除皮下组织，剩余组织在?20°C冷冻最多6个月。

Franz扩散细胞是进行皮肤吸收和渗透研究的成熟模型，经济合作与发展组织（OECD）指南也反映了这一点。作者研究小组先前使用分离皮肤进行的渗透研究已验证了Franz细胞的使用。OECD指南还确认了皮肤在冷冻≤466天或在10°C≤3天的完整性，并描述了使用全层皮肤。

冷冻皮肤样本在室温下解冻4小时。用手术刀片去除皮下组织，剪掉剩余毛发。将3×3cm大小的皮块放入1M NaCl盐裂溶液中，在4°C储存44小时。之后，用手术刀片小心刮掉分离的表皮。将样本在PBS中孵育30分钟。通过浸入消毒剂（Desmanol pure；Schülke and Mayr）去除皮肤上的污染细菌。消毒后，拍干皮肤样本并放入Franz细胞。接受室注入无菌PBS并保持在38°C，皮肤在室中适应30分钟。适应后，除阴性对照外，所有室中的皮肤样本均接种MRSP。

对每只捐赠动物准备三个皮肤样本。均用100μL PBS中的1×10⁷ cfu MRSP接种，并孵育16小时。随后8小时建立三个治疗组：0.4mg夫西地酸（第1组）（Fucidine；Leo Pharma）；2×10⁶空斑形成单位（pfu）噬菌体LmqsKl44-4（第2组）；以及两种治疗组合（第3组）。同时运行两个阴性对照：一个仅含噬菌体，一个完全空白（无细菌，无噬菌体）。细菌浓度基于先前研究选择，噬菌体浓度也是如此。

用塑料盖覆盖Franz细胞以防止污染和蒸发。所有步骤均使用无菌设备进行。从Franz细胞取出皮肤后，取样进行组织病理学检查、提取以及MRSP和噬菌体活力测试。将皮肤片从Franz细胞中取出并切成两半，一半放入10%中性缓冲福尔马林中用于组织病理学研究。从另一半取8mm打孔活检，放入2mL Eppendorf管中，在500μL蛋白胨水中使用2mm玻璃珠通过反复涡旋3次进行匀浆。为确定MRSP浓度，制备高达10^?7的系列稀释液，并重复涂布在选择琼脂平板（MRSA 2 brilliance agar；Oxoid）上，孵育16小时。其余匀浆组织液使用0.2μm PES syringe filters无菌过滤，用于通过软琼脂覆盖技术测定噬菌体浓度。

为验证离体真皮模型，在所有福尔马林固定皮肤样本中测定MRSP穿透深度。样本经常规处理，石蜡包埋，切成2–3μm。切片按标准程序进行H&E染色，由委员会认证病理学家（作者之一）使用光学显微镜评估。

应用Kruskal–Wallis检验与Dunn多重比较检验。显著值报告为：p<0.05；*p<0.01。显示中位数和95%置信区间。对于噬菌体浓度比较，噬菌体单独治疗组与FA加噬菌体组应用Wilcoxon检验。使用PRISM v10.4.1软件（GraphPad）进行分析。

结果

分离的噬菌体LmqsKl44-4在MRSP宿主菌株上形成清晰噬斑。该噬菌体被鉴定为长尾病毒科。负染电子显微照片显示，噬菌体具有二十面体头部，长宽为57nm，尾长320nm。体外协同相互作用显示，FA和噬菌体联合比单一措施具有更高生长抑制。

犬离体真皮模型在Franz细胞中运行良好，去除皮下组织并应用盐裂技术。H&E染色样本显示24小时总孵育后皮肤结构完整性良好。组织病理学评估显示球菌样细菌浅表真皮定植，也发现于毛囊内部。在一些样本中，盐裂技术产生的裂隙显示MRSP附着在表皮底部。伸入真皮的裂缝导致MRSP更深穿透。

用FA处理MRSP感染皮肤8小时导致MRSP减少（从中位数10.09降至8.67 log<10> cfu/mL），但无统计学意义（p=0.368）。单独噬菌体处理未改变MRSP数量（中位数10.28 log<10> cfu/mL）。然而，FA和噬菌体联合治疗8小时后显著减少MRSP数量（从中位数10.09降至8.29 log<10> cfu/mL，p<0.05），与未处理和噬菌体处理组相比。

MRSP感染皮肤样本上的噬菌体浓度在孵育8小时后保持稳定（中位数6.01至7.0 log<10> pfu/mL）。当与FA联合处理时，噬菌体浓度在8小时后显示下降（从7.0 log<10> pfu/mL降至中位数2.70 log<10> pfu/mL）。

讨论

伪中间型葡萄球菌中的抗菌耐药性提出了重大治疗挑战，强调需要替代或辅助治疗策略。本研究调查了两种具有不同作用机制的药物：FA——一种通过抑制细菌蛋白质合成起作用的抑菌抗生素，以及一种新分离的、针对MRSP的裂解性噬菌体，在离体犬真皮模型中。

出乎意料的是，噬菌体单一治疗未导致细菌数量的可测量减少。这一结果与噬菌体的自我复制性质及体外抗MRSP活性数据均形成对比。无效原因可能在于离体组织环境中噬菌体-细菌相互作用有限。潜在影响因素包括生物膜形成、噬菌体扩散不足、感染复数（MOI）欠佳以及复制窗口期受限。虽未确认生物膜存在，但不能排除。噬菌体失活似乎也不可能，因孵育后回收到存活噬菌体。支持这一观察，Weissfuss等（2023, 2025）在小鼠模型中量化细菌和噬菌体，使用cfu和pfu评估微生物存活力。噬菌体活性受MOI影响；本研究使用相对较低的0.2 MOI以评估与FA的潜在协同作用，而非最大化噬菌体单一疗效。先前研究表明，MOI≥1——噬菌体与细菌浓度相等——且噬菌体滴度≥10⁸ pfu/mL，是实现最佳细菌吸附和杀灭所必需。尽管MOI低于治疗水平，FA与噬菌体联合治疗显著降低MRSP水平，表明协同相互作用。

单用FA也减少MRSP计数，与先前其通过抑制蛋白质合成起抑菌活性的报告一致。然而，效果未达统计学显著性，可能由于8小时短孵育时间。临床实践中，局部FA通常每12小时应用一次，疗程≥7天，可能产生更明显效果。

噬菌体和FA联合治疗导致皮肤上MRSP显著减少，与噬菌体-抗生素协同（PAS）概念一致。PAS发生在噬菌体和抗生素同时给药时，增强杀菌效果，超越任一药物单独Achieve。尽管FA已知阻断蛋白质合成，是否增加MRSP对噬菌体裂解的敏感性仍不清楚——可能通过修改细菌表面受体或破坏应激反应途径。有趣的是，噬菌体浓度在8小时孵育期间下降，尽管预期噬菌体在细菌宿主内复制后才诱导裂解。这可由几种机制解释。一种可能性是“自动给药”，其中少量噬菌体跨多个细菌世代复制以实现细菌清除，其中噬菌体浓度随细菌宿主密度波动。或者，可能发生被动裂解——无噬菌体复制的杀灭。通过协同作用的早期细菌杀灭、噬菌体失活或与非特异性结合受损或垂死细菌细胞可能限制了复制周期数，从而降低总体噬菌体滴度。亚致死细菌应激或改变代谢可能增强噬菌体附着或加速裂解，即使无生产性复制。虽然8小时短复制时间先前已有讨论，值得注意的是，最近一项研究证明了噬菌体早期体内效应——单独及与美罗培南联合——在铜绿假单胞菌小鼠呼吸机相关性肺炎模型中感染后4和8小时。

除与抗生素相互作用外，噬菌体的物理特性——包括衣壳大小和形态——可能影响其穿透组织能力。本研究中使用的相对较大噬菌体尺寸可能导致真皮扩散有限，尽管表面相关细菌可能仍暴露。为在感染部位输送足够高噬菌体浓度，局部噬菌体应用的特定配方将在未来治疗脓皮症中发挥重要作用。此外，噬菌体鸡尾酒已证明在治疗细菌感染和降低耐药性发生可能性方面具有优越疗效，尽管潜在机制尚未完全理解。对于我们如先前所述的概念验证研究，在此设置中选择单一噬菌体。

为促进MRSP真皮定植，我们使用改良Franz细胞设置修改犬皮肤样本。这些细胞传统上与完整分层皮肤一起使用以评估透皮药物渗透，角质层（SC）和表皮作为基本屏障。因此，通过去除SC或表皮修改已建立的Franz细胞模型对于模拟真皮感染是必要的。由于SC去除不一致（数据未显示），拒绝胶带剥离和氰基丙烯酸酯方法。相反，我们调整了盐裂技术，通常用于创建真皮-表皮裂隙以进行免疫组化分析。裂隙形成后，我们机械去除表皮。组织学分析显示，MRSP穿透浅表真皮和毛囊，但未到达更深真皮层。延长孵育超过16小时可能改善细菌穿透，但延长盐裂处理后观察到的组织降解限制了我们当前设置中的这种方法。

有趣的是，当存在裂隙时，MRSP经常附着在表皮基底表面。这种行为可能由深层角质形成细胞或角化细胞上的粘附分子介导，它们在真皮中缺失，值得进一步研究，特别是在临床活检标本中。为最小化变异，我们仅包括短毛犬品种，通常表现休止期毛囊周期。这与贵宾犬等品种形成对比，其中≤98%毛囊处于生长期。毛囊周期阶段影响皮肤形态和药物渗透；因此，品种选择有助于标准化实验条件。

研究的一个限制是小样本量。一只犬因对照组中异常低MRSP水平被排除，可能源于未记录的先前抗菌暴露。如果盐裂技术可以被取代，可能改善更深细菌接种和延长治疗持续时间。此外，未在组织切片中可视化噬菌体。应用噬菌体的尺寸可能限制真皮渗透，尽管它可能到达暴露表皮表面的细菌。先进成像技术，如金标电子显微镜，可能有助于在未来研究中验证噬菌体位置。

结论

在抗菌耐药性上升的背景下，迫切需要创新策略对抗细菌皮肤感染。我们的研究表明，局部噬菌体-抗生素组合可能提供一种有前景的方法，减少对全身抗生素的依赖，从而可能最小化环境污染和减缓抗生素耐药性出现。