韩牛犊牛重症新生儿腹泻预测模型的开发与外部验证：基于动物、环境和管理风险因素的多变量分析

本研究开发并外部验证了一个针对韩牛犊牛重症新生儿腹泻（NCD）的预测模型，整合了动物（如胎次、胎盘滞留）、环境（如雨季、垫料类型）和管理（如被动免疫失败管理FTPI）等多维度风险因素。该模型具有较高的预测准确性（AUC=0.79）和临床实用性，为牧场级早期干预和精准防控提供了重要工具。

　　

摘要

背景

新生儿犊牛腹泻（NCD）是韩牛犊牛断奶前死亡的主要原因。开发一种新型的重症NCD预测模型将有助于兽医和养殖户预防犊牛疾病。

假设/目标

为韩牛犊牛重症NCD开发并外部验证一种简易预测模型。

动物

使用韩牛犊牛数据进行模型开发（n=3179）和外部验证（n=1383）。

方法

回顾性观察研究。利用2019年至2022年的韩牛犊牛数据，通过Logistic回归分析开发预测模型，并使用2018年和2023年的数据进行外部验证。

结果

经过单变量和多变量Logistic分析，最终筛选出的预测因子包括出生月份、雨季天气、妊娠持续时间、母牛胎次、胎盘滞留、NCD流行率、分娩诱导、垫料类型以及被动免疫失败（FTPI）管理。模型敏感性为74.1%（95% CI: 68.9%–78.7%），特异性为72.2%（95% CI: 70.6%–73.8%）；曲线下面积（AUC）为0.79（95% CI: 0.766–0.814）。在外部验证中，准确率达到83.3%（95% CI: 81.2%–85.2%），敏感性和特异性分别为60%（95% CI: 50.0%–69.3%）和85%（95% CI: 82.9%–86.9%）。

结论与临床重要性

我们确定了韩牛犊牛重症NCD的预测因子，并基于这些因子开发了一个简单易算的评分预测模型。

引言

韩牛是韩国本土肉牛品种，通常与母牛同在牛舍中饲养，并在3–4月龄断奶。因此，韩牛犊牛NCD发病率较高，在1月龄内犊牛死亡中占很大比例。在韩国，NCD导致韩牛和乳牛犊牛死亡率分别达48.8%和41.6%。

NCD通常由牛轮状病毒、牛冠状病毒、隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原引起。其主要病理生理机制为毒素引起的分泌性腹泻或绒毛损伤导致的消化吸收不良性渗透性腹泻，进而引发脱水、代谢性酸中毒和电解质紊乱，常需要口服或静脉补液治疗。重症NCD会导致犊牛生长受阻和治疗成本增加，造成经济损失。

已知NCD的风险因素包括母牛营养、难产、母牛胎次、饲养密度、垫料、牛舍排水与通风、初乳管理、疫苗接种、恶劣天气条件、潮湿环境及牛群规模等。预防NCD的管理措施包括减少病原暴露、增强特异性和非特异性免疫力、保证充足初乳摄入及加强农场生物安全。

本研究旨在开发一个便于韩牛养殖户和兽医使用的预测模型，用于评估韩牛犊牛发生重症NCD的可能性，模型综合考虑犊牛特征、母牛相关变量及环境影响等因素。与现有主要分析腹泻风险因素的预测模型不同，本研究优先识别重症NCD的预测因子，并基于这些因子构建一个简单易用的评分预测模型。

材料与方法

动物

2019年至2022年间，在一个大型韩牛牧场共注册了3328头犊牛；剔除死产和出生后立即死亡的124头犊牛，以及意外死亡的25头犊牛后，最终共有3179头犊牛用于模型开发。2018年和2023年共产犊1440头，剔除43头死产和14头意外死亡犊牛后，剩余1383头犊牛用于外部验证。该实验农场采用季节性繁殖体系，每年2月至4月和8月至10月为产犊期。分娩在独立的散养式牛舍中进行，分娩后1–2天，母犊对被移至群养散养牛舍，每个牛舍容纳45对母犊。母牛饲养和犊牛断奶方案每年保持一致。

数据资源

2018–2023年数据集的所有信息均来自同一大型韩牛牧场。由农场人员记录犊牛、母牛及环境因素信息，由驻场大动物执业兽医记录疾病诊断和治疗信息。医疗记录包括个体临床症状、临床病理学结果和用药史。死亡犊牛由驻场兽医进行剖检，并记录剖检报告。

记录的变量包括：产犊日期、母牛胎次、出生重、妊娠持续时间、分娩难度、胎盘滞留、分娩诱导、垫料类型（稻草、谷壳）、消毒剂使用、疫苗接种、FTPI管理以及非特异性免疫支持补充剂（非处方）。利用韩国气象厅开放数据门户分析雨季天气。

正常出生重定义为20–45 kg，<20 kg为低体重，>45 kg为高体重。正常妊娠持续时间平均为285天，271–299天定义为正常范围，≤270天为早产，≥300天为过期产。分娩难度分为五类：无需助产、1–2人助产、3–4人助产、机械助产（产科滑轮）和剖腹产。胎盘滞留定义为分娩后24小时未排出胎衣，由兽医诊断。NCD流行率定义为：在转入群养牛舍后5天内，该牛舍中犊牛总数至少有1天出现≥3%的个体发生轻度NCD。

rotavirus-coronavirus病毒疫苗（BoviROCO, Green cross veterinary products Inc., Korea）的免疫程序为：初产母牛产前6周和4周各肌注一次，经产母牛产前4周免疫一次。实验农场2019年使用针对口蹄疫（FMD）的柠檬酸基消毒剂，2020–2021年使用2%甲酚溶液，2022年使用5%次氯酸钠溶液。

农场人员使用威斯康星大学麦迪逊兽医学院开发的犊牛评分表，将犊牛粪便分为4个等级：0分-正常；1分-半成形、糊状；2分-松散但能留在垫料上；3分-水样、渗入垫料。每天观察两次粪便，将评分≥1分的犊牛转交兽医。需要补液治疗的重症NCD诊断依据包括：眼球凹陷、皮肤弹性测试等脱水体征，以及神经系统检查结果。若确认脱水或疑似代谢性酸中毒（即使无脱水），则进行血气分析（i-STAT device and EC8+ cartridge, Abbott Point of Care Inc., USA）。血液从颈静脉厌氧采集，并在农场或送检30分钟内分析。血气分析校准至39.5°C。脱水≥8%且伴静脉血pH≤7.2、总CO₂降低的代谢性酸中毒被诊断为重症NCD，并进行静脉补液治疗。脱水6%和轻度酸中毒（pH>7.2）不被视为重症NCD，但根据需要给予口服补液。犊牛重症或轻度NCD的发生在出生后4周内观察。

统计分析

以NCD为结局，采用多元Logistic回归分析开发预测模型。在2019–2022数据集中，纳入既往研究中与重症NCD相关的变量。首先进行单变量分析，再进行多变量分析。预测因子筛选标准：单变量Logistic回归中p<0.25或认为与NCD发生有关的变量进入多变量分析。采用方差膨胀因子进行多重共线性分析。最终预测因子通过向前和向后逐步选择法确定。尽管最终模型依据统计显著性确定，但从初始到最终模型的递进过程中综合考虑了统计和定性判断，以避免遗漏重要预测因子。

重症NCD的风险评分通过最终多变量Logistic回归模型的β系数计算发生概率。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析评估模型的区分度，以重症NCD发生概率为自变量，重症NCD发生为因变量。根据ROC曲线确定cut-off值。采用校准曲线、Hosmer-Lemeshow检验和校准斜率评估模型校准度。

将2019–2022数据作为开发集，2018（最早）和2023（最新）数据作为验证集进行外部验证。利用2019–2022开发数据构建的NCD发生概率在2018和2023数据集上进行验证，计算准确度、敏感性和特异性。p<0.05认为有统计学意义。所有分析使用SPSS Statistics 29和R语言（4.3.3版）完成。

结果

单变量Logistic回归分析

开发数据集中重症NCD组和正常组犊牛的特征见表S1。2019–2022年间年度气候条件、特定管理实践及轻度和重度NCD流行率总结于表1和表2。2019–2022年间重症NCD首次发生的中位时间为7天，四分位距为3天。

分析显示，母牛因素中，第一和第二胎次、胎盘滞留和分娩诱导会增加重症NCD风险。环境因素中，出生月份（3月、4月、9月、10月）和雨季天气增加风险。牛舍中犊牛腹泻发生率>3%时，重症NCD优势比更高。管理方面，使用FMD消毒剂（柠檬酸）会增加疾病暴发风险，而使用5%次氯酸钠则降低风险。疫苗接种和FTPI管理降低重症NCD发生风险（表3）。

预测模型的开发、区分度与校准

经多变量Logistic回归，最终筛选出的预测因子包括：胎盘滞留、分娩诱导、母牛胎次、出生月份、妊娠持续时间、垫料类型和FTPI管理（表4，图1）。为便于使用，所有预测因子设为分类变量。出生月份和妊娠持续时间为多分类，雨季天气、母牛胎次、胎盘滞留、NCD流行率、分娩诱导、垫料类型和FTPI管理为二分类。

增加重症NCD风险的预测因子包括：胎盘滞留、分娩诱导、第一和第二胎次、早产、谷壳垫料。降低风险的预测因子包括：第三及以上胎次、稻草垫料、过期产和FTPI管理（表4，图1）。

利用各预测因子的β系数为2019–2022数据集创建风险评分变量并进行ROC曲线分析。最佳cut-off值为0.109，AUC为0.790（95% CI: 0.766–0.814），敏感性0.741（95% CI: 0.689–0.787），特异性0.722（95% CI: 0.706–0.738；图2）。校准曲线和Hosmer-Lemeshow检验表明Logistic预测模型拟合良好（p=0.31；图3）。校准斜率为1.00（95% CI: 0.88–1.13）。基于Logistic回归分析绘制列线图（图4）计算重症NCD发生概率。并为韩牛养殖户和大动物临床医生开发了简化计算的应用程序（图S1）。

预测模型的外部验证

为进行稳健验证，使用最早（2018）和最新（2023）数据进行外部验证。将2018和2023数据集代入预测模型，准确度为0.833（95% CI: 0.812–0.852），敏感性0.600（95% CI: 0.500–0.693），特异性0.850（95% CI: 0.829–0.869）。

讨论

母牛胎次、胎盘滞留、分娩诱导和妊娠持续时间被确定为母牛和犊牛相关因素，而雨季天气、垫料类型和FTPI管理则是作为环境因素的最终预测因子。

分娩诱导是NCD的已知风险因素。有研究者认为诱导分娩导致的早产会造成犊牛消化系统发育不全，增加对腹泻病原的易感性。但在本研究的32头人工诱导分娩犊牛中，11例重症NCD有72.7%与正常妊娠期相关，9.1%和18.2%分别与早产和过期产相关。这表明，NCD可能与诱导分娩导致的母牛初乳产量下降以及外源性皮质醇引起的母犊应激关系更密切，而非早产导致的胃肠道不成熟。这一系列事件可能削弱犊牛免疫系统，从而影响NCD发生。

24头犊牛来自胎衣滞留母牛，其中8头发生重症NCD。这8头犊牛的母牛中有75%接受了≥5天的抗生素治疗，而未发生重症NCD的16头犊牛的母牛中仅56.3%接受了1–2天治疗。更严重的胎衣滞留母牛在牛舍中卧地时间多于站立，导致犊牛吮吸时间和母性照顾减少。综合这些结果，本研究认为胎衣滞留可能是增加重症NCD发生率的预测因子。

初产母牛所产犊牛的NCD发生率是经产母牛的3.9倍，这归因于初产母牛奶量、初乳质量和母性能力较低。早产会导致犊牛死亡率增加和生长不良。本研究中，早产被选为重症NCD的最终预测因子。韩牛早产犊牛往往体弱，卧地时间长，增加了与地面污染物的接触时间，可能促进NCD发生。体弱早产犊牛也更难摄入充足初乳。

难产是NCD的已知风险因素，它影响犊牛吮吸能力，减少初乳摄入，增加发病率。经历难产的母牛往往拒绝哺乳犊牛。本研究对四个等级的分娩难度进行了单变量和多变量Logistic回归分析，但分娩难度并非重症NCD的显著预测因子。这一结果可能与既往研究目标是NCD发病率，而本研究目标是NCD严重程度有关。

潮湿环境或积水可导致犊牛腹泻，若哺乳区>5%面积受影响则风险更高。2019–2022年间，8月和9月平均雨天数（及平均降雨量）分别为15.3天（329.9 mm）和9天（201.6 mm），而2月平均为7天（35.7 mm）。8月和9月的高降雨量和雨天数可能 contributed to 重症NCD发生率增加。尽管3月和4月平均雨天数（及降雨量）相近（分别为6.5天/46.3 mm和7天/38.9 mm），但3月和4月重症NCD发生率高于2月，似乎与这两个月份NCD流行率更高有关。此外，考虑到实验农场实行春、秋两季产犊，每个产犊季的最后月份（4月和10月）重症NCD发生率高于2月（产犊期初期），这与既往研究显示的随产犊季进行犊牛腹泻发生率增加的结果一致。

实验农场牛舍消毒先用水和肥皂物理清除污染物，2019年使用商品化FMD消毒剂（苯扎氯铵和柠檬酸复合制剂），2020–2021年使用2%甲酚溶液，2022年使用5%次氯酸钠溶液。单变量分析显示，与2%甲酚溶液相比，使用FMD消毒剂与重症NCD发生率增加相关，这与既往研究显示的甲酚溶液对革兰氏阴性菌、无囊膜病毒（如轮状病毒）及隐孢子虫的消毒效力一致。然而，使用5%次氯酸钠（无抗隐孢子虫活性文献记载）却观察到重症NCD发生率下降，这与既往研究矛盾。此外，消毒剂应用未成为多变量Logistic回归的最终预测因子，表明其影响相对其他因素较小。

韩牛养殖户主要使用稻草、谷壳和锯屑作为垫料。本研究分析了谷壳和稻草，未分析锯屑。作为有机垫料，稻草和谷壳会因湿度增加促进细菌增殖。本实验中，与稻草相比，使用谷壳显著增加了重症NCD发生率。这与既往研究显示的谷壳相对于稻草会提高牛舍地板清洁度评分和粪便流动性评分一致。谷壳比稻草保水性更强，颗粒更细导致与犊牛接触时间延长，可能 facilitate 病原传播。犊牛大部分时间卧地，可能有意或无意摄入垫料。韩牛犊牛消化系统异物（如毛球和干草）导致的皱胃阻塞已有报道。本研究中，多数重症NCD死亡犊牛皱胃内发现未消化的谷壳。

NCD流行率增加了重症NCD风险，但优势比低于预期。这表明NCD病原传播给犊牛并非 solely attributable to 其他犊牛。本研究中，初产母牛在每个产犊群中占比>24%。既往研究将初产母牛比例>20%确定为NCD风险因素。此外，据报道，感染轮状病毒和牛冠状病毒的初产母牛所产犊牛比感染多胎母牛所产犊牛更易发生NCD。我们认为这一因素导致了NCD流行率调整后优势比低于预期。

除非发生宫内感染，新生犊牛是免疫学意义上的 na?ve 个体。犊牛出生后24–36小时内摄入初乳建立被动免疫，维持3–5周，直至适应性免疫发育成熟。FTPI导致的初乳摄入不足据报道会增加犊牛死亡率。本研究中，FTPI管理被选为最终预测因子。除了对诊断为FTPI的犊牛及时给予初乳替代品外，还努力增强母牛的母性照顾能力，包括限制母牛活动以辅助哺乳和增加母犊互动时间。值得注意的是，实验农场初产母牛比例持续较高（2019年26.2%，2020年24.5%，2021年24.8%，2022年26.1%）。鉴于初产母牛母性照顾能力通常低于经产母牛，农场人员主动干预以提高这种能力可能 contributed to FTPI管理的改善，从而 potentially leading to 重症NCD发生率下降。

本研究中，轮状病毒和冠状病毒疫苗接种在单变量回归中显著，但未成为多变量回归的最终预测因子。这是因为本研究关注NCD严重程度而非发病率，并且认为用于韩牛母牛免疫的冠状病毒毒株与实际引起韩牛犊牛暴发的毒株不同。我们同意疫苗接种是预防NCD的一种方式，但不能替代适当的管理。此外，许多韩牛养殖户为新生犊牛提供补充剂。本研究中分析了两种补充因素（免疫增强剂和卵黄源免疫球蛋白），未发现显著结果。

研究的局限性

本研究存在两个主要局限性。首先，受田间条件多样性限制。已知风险因素如牛群规模、 housing 类型、牛舍通风及母牛和青年母牛是否混养等未被选为预测因子。此外，研究仅在单一大型农场进行是一个重大局限。我们努力通过分析实验农场数据与典型韩牛农场的共性来推导预测变量。幸运的是，未发现实验农场数据中存在区别于其他农场的独特饲养管理实践。其次，缺乏血清生化谱 prevented 创建临床模型。然而，利用来自大型单一农场的准确记录信息，我们提高了预测模型的准确性，并且使用已知风险因素作为预测因子创建便于养殖户使用的预测模型非常重要。

结论

总之，通过单变量和多变量Logistic回归分析，阐明了母牛和犊牛风险因素（包括出生重、双胎、难产、母牛胎次、胎盘滞留、分娩诱导和妊娠持续时间）、环境风险因素（如哺乳区、出生月份、NCD流行率、消毒剂、垫料类型和雨季天气）以及管理风险因素（如疫苗接种和FTPI管理）。增加韩牛犊牛重症NCD发生率的预测因子包括：胎衣滞留、诱导分娩、雨季天气、出生月份（4月、5月、10月、9月、8月）、胎次（≤2）、NCD流行率、早产、垫料（谷壳）；降低发生率的预测因子包括：过期产和FTPI管理。

致谢

感谢韩牛遗传改良中心的工作人员。

利益冲突披露

作者声明无利益冲突。

伦理批准

研究获得韩国国立畜产科学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（JBNU IACUC no. NON2023-123）。作者声明不需要人类伦理批准。