中国北方地区牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查与系统发育分析

本研究首次对中国北方六省（内蒙古、山西、河北、辽宁、黑龙江、山东）的牛呼吸道疾病综合征（BRDC）进行了大规模流行病学与系统发育分析，揭示了病毒（BVDV、BRSV、BPIV-3、BHV-1）与细菌（M. bovis、P. multocida、M. haemolytica）的共感染动态、季节分布规律及病原体与全球毒株的进化关联，为区域化疫苗策略和生物安全防控提供了关键科学依据。

　　

引言

牛呼吸道疾病综合征（Bovine Respiratory Disease Complex, BRDC）是全球养牛业面临的最严重疾病之一，其病原复杂性和经济威胁已成为兽医流行病学研究的焦点。该疾病以病毒和细菌的一种或多种病原混合感染为特征，临床表现包括发热、咳嗽、肺炎和死亡，对处于不良条件和频繁运输的动物健康造成沉重负担。全球超过一半的奶牛疾病与BRDC相关，具有高流行率和低死亡率的特点。

在中国北方，寒冷气候、高牲畜密度以及频繁的运输和交易条件下，BRDC疫情广泛传播。本研究聚焦中国北方的六个省份：内蒙古、山西、河北、辽宁、黑龙江和山东。这些地区属于温带大陆性气候，季节变化显著。冬季从11月到次年3月，以极端寒冷（平均气温：-20°C至-5°C）和低湿度（30%–50%）为特征；夏季从6月到8月，温暖湿润，气温在18°C至25°C之间，相对湿度为60%–80%。这种极端气候，结合集约化畜牧业实践，可能通过延长病毒在寒冷干燥空气中的稳定性以及热应激增加宿主易感性而加剧呼吸道病原体的传播。

本研究旨在通过病毒和细菌分离、分子鉴定及系统发育分析，系统调查中国北方BRDC病原体的流行情况、遗传多样性及共感染动态。具体而言，我们专注于：（1）表征荷斯坦犊牛中的优势病毒和细菌病原体；（2）分析其季节和区域分布模式；（3）重建中国分离株与全球毒株之间的系统发育关系。系统发育分析对于追踪病原体起源和传播路线、识别影响疫苗效力的新兴变异以及为跨境疾病监测提供分子证据至关重要——从而弥补区域BRDC控制策略的空白。

BRDC病原体包括两类：病毒和细菌（包括支原体）。病毒通常是主要感染源，首先攻击呼吸道黏膜屏障并促进细菌感染。主要的病毒病原体是BHV-1、BVDV、BRSV和BPIV-3。最流行的细菌病原体是Mycoplasma bovis（M. bovis）、Pasteurella multocida（P. multocida）和Mannheimia haemolytica（M. haemolytica）。近年来，M. bovis的感染率显著增加，特别是与病毒的共感染变得尤为严重。例如，M. bovis与BVDV共感染可导致牛巨噬细胞（Bomac细胞）的毒性和凋亡。

病原体的协同机制是BRDC的一个优先研究领域。例如，BRSV感染允许呼吸道细胞表面表达黏附分子，从而使P. multocida能够快速定植。另一方面，BHV-1的潜伏感染特性使得病毒在应激期间重新激活，从而促进了牛的继发性细菌感染。此外，双重细菌感染（例如，Pasteurella与Mycoplasma）可能通过其毒力因子的相互作用放大肺损伤。这些结果意味着BRDC的预防和控制可以从解决单一病原体转向处理多病原体相互作用的问题。

目前，在中国北方，由于经济限制和分散的兽医服务，大多数小规模农场并未广泛实施BRSV疫苗接种。然而，一些大型奶牛养殖场已为犊牛采用了常规的BRDC疫苗接种计划，主要使用灭活或亚单位疫苗。尽管做出了这些努力，覆盖率仍然不一致，并且疫苗效力可能受到田间毒株异质性的影响。

这项研究是中国北方首次对BRDC病原体进行大规模分离和鉴定。结合病原体分离、鉴定、测序和系统发育分析，本研究的结果将为制定区域化的BRDC预防和控制计划提供数据支持，并为理解多病原体共感染的分子机制提供理论基础。

材料与方法

样本采集与处理

所有实验方案均经呼和浩特内蒙古农业大学动物疾病临床诊断与治疗重点实验室批准（批准号NND2021108，2021年12月20日）。本文描述的所有方法均按照相关伦理指南和法规进行。从2022年1月到2024年12月，我们分析了中国北方有BRDC症状的荷斯坦犊牛（5-10月龄）的5052份样本。5052份样本均无菌采集，每头犊牛贡献单一类型样本，包括鼻拭子（n = 3347）、血清（n = 1423）和死后肺/气管组织（n = 282）。鼻拭子浸泡在运输培养基（DMEM）中。样本在采集后2小时内于干冰上运输至实验室，并在-80°C下长期保存。肺/气管组织被冷冻切片成1 cm³的立方体，通过低温研磨（Retsch MM400）均质化，并保存在液氮中。血清经过过滤（0.22 μm PVDF膜），分装并在-80°C下快速冷冻。

细菌和病毒的分离与培养

按照前述预处理后，使用无菌接种环将组织和鼻拭子样本接种到新鲜制备的全血琼脂培养基上。一份样本与固体培养基一起置于37°C的厌氧罐中，另一份置于37°C的恒温培养箱中。培养24小时后，观察菌落特征，并用无菌接种针挑取半个单菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态，然后挑取同一菌落的另一半，接种到营养肉汤培养基中，并在37°C下培养用于后续实验。

同时，将预处理后的牛鼻拭子和组织样本涂布在含有5%酵母提取物、20%马血清、200 IU/mL青霉素、0.125 mg/mL丙酮酸钠和2%琼脂的PPLO固体培养基上，在37°C、5% CO₂条件下培养5-7天。使用光学显微镜观察菌落。用接种针挑取单个菌落，放入3 mL PPLO液体培养基中，在37°C、5% CO₂条件下培养5-7天用于后续实验。

收集的牛鼻拭子、组织和血清样本接种到三瓶单层Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞中，并向培养基中加入1%的双抗，然后在37°C下孵育2小时。加入基本DMEM培养液（3 mL），每24小时观察一次细胞病变效应（CPE），持续5天，当80%的细胞出现CPE时收集培养物。收集感染BHV-1、BVDV、BPIV3和BRSV的MDBK细胞培养物，在-80°C和室温（23-25°C）下反复冻融三次，以1000 rpm离心10分钟以去除细胞碎片，并收集上清液用于PCR分析。

分子鉴定

使用DNA/RNA提取试剂盒（TIANGEN，中国）按照制造商方案从血清、细菌培养物、M. bovis培养基和病毒裂解液中提取核酸。简要来说，样品用Buffer RL裂解，并以12000 × g离心1分钟。DNA/RNA用50 μL洗脱缓冲液洗脱，并保存在–80°C直至进一步分析。对于RNA病毒（BVDV、BRSV、BPIV3），使用TransScript一步法RT-PCR SuperMix进行逆转录，按照制造商说明进行。将RNA（8 μL）与2 μL的5×TranScript II All-in-One SuperMix混合，在50°C下孵育15分钟，然后在85°C下灭活5秒。cDNA在RT-PCR扩增前保存在–20°C。PCR扩增（25 μL体系）靶向：（1）BHV-1 gD基因（MG407792.1），（2）细菌16S rRNA V3–V4区，（3）M. bovis PpSM基因，（4）P. multocida KMT1基因，和（5）M. haemolytica gcp基因。RT-PCR（TaKaRa一步法系统）检测BVDV（5'-UTR；XM_040428314.1）、BRSV（N基因；NC_038272.1）和BPIV3（M基因；NC_006430.2）。所有引物（由本实验室保存）见表1。循环条件：95°C（5分钟），95°C/30秒、靶标特异性退火/45秒、72°C/1分钟/kb的35个循环，以及最终延伸（72°C/10分钟）。扩增产物进行电泳（1.5%琼脂糖，100 V/30分钟），切下目标DNA条带并使用DNA凝胶提取试剂盒（Axygen，美国）按照制造商方案进行纯化。纯化的DNA通过Sanger测序进行双向测序，并进行系统发育分析（MEGA-X，邻接法，1000次bootstrap重复）。

病原体表征

使用含有葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和甘露醇的商业生化试管（广州环凯微生物科技有限公司，中国）测定细菌生化反应。试管在37°C下孵育48小时。根据制造商说明（颜色变化表示产酸，气泡表示产气）解读反应。对P. multocida和M. haemolytica进行了生化分析。我们使用透射电子显微镜（TEM）检查显示CPE和PCR阳性的病毒培养物：裂解液离心（12,000 × g/10秒），灭活（56°C/30分钟），在Formvar包被的载网上用2%磷钨酸（pH 6.8）负染，并成像病毒粒子结构（JEM-1400 TEM，80 kV）。

数据分析

使用IBM SPSS Statistics for Windows, Version 28.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA; released 2021）进行统计分析。汇总2022年至2024年的监测数据，计算病原体特异性阳性率（即病原体阳性样本数占总测试样本数的比例）。通过描述性统计评估时间趋势，分类变量（例如，病原体检测率的季节性变化）使用卡方检验进行分析。连续变量（例如，年度流行趋势）通过单向方差分析（ANOVA）进行比较。

结果与分析

细菌分离与表型表征

按照标准细菌学方案，M. haemolytica和P. multocida被确定为主要细菌病原体。M. haemolytica菌落在血琼脂上呈现光滑形态，具有弱β-溶血（图1A），而P. multocida形成凸起菌落，具有两极染色特征（图1C）。革兰氏染色确认两个物种均为革兰氏阴性杆菌（图1B,D）。M. bovis在PPLO琼脂上显示出独特的“煎蛋”形态（图2），与其苛求的生长要求一致。

病毒分离与细胞病变效应

MDBK细胞中的病毒增殖（章节2.2）揭示了不同的细胞病变模式：BVDV，非致细胞病变生物型占主导（分离株的72%），在接种后72小时诱导空泡形成和细胞脱落（图3A）；BHV-1，在36小时内观察到快速的细胞融合和空泡形成（图3B）；BPIV-3，在72小时时合胞体形成变得明显（图3C）；BRSV，早在36小时就出现细胞变圆和融合（图3D）。

生化与分子鉴定

生化分析（章节2.4）区分了P. multocida（葡萄糖阳性、蔗糖阳性、吲哚阳性）和M. haemolytica（乳糖阳性、甘露醇阴性）（表2）。PCR扩增（章节2.3）产生病原体特异性条带：细菌靶标：P. multocida（约460 bp）、M. haemolytica（约227 bp）和M. bovis（约442 bp）（图4A–C）；病毒靶标：BVDV（约287 bp）、BHV-1（约306 bp）、BPIV-3（约328 bp）和BRSV（约459 bp）（图4D）。测序验证确认扩增产物与目标病原体的保守区域高度一致。

系统发育关系

系统发育重建（章节2.3）显示如下：BVDV亚基因型1a（n = 4，毒株：20010, 9451, 8909, 20017）和1d（n = 4，毒株：2484, 59324, 8190, 9547）与北美/欧洲毒株密切相关（图5A）；BPIV-3（n = 4，毒株：2484, 59324, 8190, 9547）与土耳其BPIV-3c毒株形成一个单系群（图5B）；BHV-1（n = 8，毒株：581184, G2388, 56456, 460486, 163432, 3475, 3440, 1149）与参考毒株C36876-459聚集在同一分支，并被分类为亚型BHV-1.1（图5C）；BRSV（n = 4，毒株：1582, 8921, 9847, G9061）被分类为基因型III（图5D）；M. bovis（n = 6，毒株：50, 41817, 78, 182120, B03766, BYX8）与全球参考毒株表现出>98.7%的同源性（图5E）。P. multocida：基于KMT1基因测序的一个代表性分离株（毒株：G2288）与参考毒株39639聚集，并被分类为A型（图5F）。M. haemolytica：通过gcp基因比对分析的一个毒株（毒株：5053）与参考毒株183（GenBank: KY242518.1）和MS/Alex-2（GenBank: CP047557.1）显示出99.2%的同源性，并被分类为血清型A1（图5G）。

病毒超微结构特征

透射电子显微镜（章节2.4）解析了病毒粒子形态——BVDV：球形颗粒，直径60 ± 5 nm（图6C）；BHV-1：有包膜病毒粒子，直径120 ± 10 nm（图6B）；BPIV-3：带有表面突起的包膜颗粒（180 ± 15 nm）（图6A）；BRSV：球形结构（80 ± 5 nm）（图6D）。

流行病学趋势

在此次流行病学调查中，病毒阳性总数为2974，细菌阳性总数为953。季度平均阳性率分别为BVDV（21.58%）、BHV-1（12.73%）、BPIV-3（16.94%）、BRSV（6.98%）、P. multocida（4.04%）、M. haemolytica（5.54%）和M. bovis（9.74%）。统计分析（章节2.5）揭示——病毒季节性：Q1（72.85%，n = 965/1425）和Q4（67.72%，n = 896/1230）的检测率显著升高（χ² = 54.18，p < 0.001；图7），基于卡方检验的p值分析显示各季度单个病毒的感染率存在高度显著差异；年度动态：BVDV流行率从21.55%（2022年）下降至20.48%（2024年）（ANOVA：F = 2.883，p = 0.1027），而BRSV从2.63%上升至10.3%（F = 1.539，p = 0.2778）（图8B），根据单向方差分析，各年份每种病毒的感染流行率没有差异；细菌季节性：三种细菌感染的流行率季节性变化不显著（χ² = 39.19，p = 0.21；图9B）；年度动态：M. bovis保持优势地位（平均流行率：9.74%，F = 6.098，p = 0.0183），P. multocida的流行率（F = 9.236，p = 0.0056）范围从2.35%到5.34%，M. haemolytica（F = 4.291，p = 0.0442）范围从2.99%到11.24%。各年份每种细菌的感染流行率没有差异。

共感染动态

混合感染分析（表3）表明：病毒-病毒共感染占主导地位，特别是BVDV/BPIV-3（3.98%，n = 201/5052）和BVDV/BHV-1（2.63%，n = 133/5052）；病毒-细菌相互作用较少见，例如BHV-1/M. bovis共检测（1.58%；χ² = 67.2，p < 0.001）。

基于流行率、共感染和亚型评估的疫苗靶点优先排序

为了将流行病学发现转化为可操作的干预措施，我们根据病原体流行率、共感染负担和亚型分布评估了疫苗接种优先级（表4）。BVDV和BPIV-3因其高共现率、在多病原体感染中的主导地位以及有匹配区域亚型（1a/1d和3c）的可用疫苗而成为最高优先级的靶点。

讨论

BRDC仍然是一个重要的全球养牛业问题，其多因素病因学和经济影响需要特定区域的流行病学见解。本研究首次全面调查了中国北方BRDC病原体的多样性、传播动态和系统发育关系，该地区以高牲畜密度、极端气候和频繁的省际牛只流动为特征。研究结果深刻揭示了病原体的个体和集体感染状况，并强调了异源毒株之间的进化关系，从理论上最大化了地方性控制措施。

中国北方的BRDC流行病学具有精确的区域和季节分布。华北四省大型奶牛场的BRSV抗体阳性率为67.4%，BHV-1感染率超过50%，随着动物交易强度和养殖密度的增加，混合感染率更高。在内蒙古的低温条件下，尤其是冬季封闭的饲养室，BRDC的发病率是夏季的2.3倍。病原体混合感染呈上升趋势：病毒混合感染（如BHV-1 + BRSV）占42%，病毒细菌混合感染（如BRSV+M. haemolytica）占38%。

分离和鉴定病毒和细菌病原体展示了复杂的主要和次要病原体相互作用。与全球趋势一致，BVDV、BRSV、BPIV-3和BHV-1相关病毒病原体在BRDC病例中占主导地位，通常损害呼吸防御。M. bovis感染与其他病原体的协同形式已被证明是BRDC的发病机制。根据研究，该病原体在混合感染中的流行率已接近流行性呼吸道感染，地理位置的畜群监测研究支持了这一流行病学观察。协同致病机制（例如，BHV-1介导的宿主细胞黏附分子表达上调增强了M. haemolytica对下呼吸道上皮的黏附）已被证明。我们的研究结果强调，需要基于病原体生态学的综合策略，这些策略比针对单一病原体的方案更有效，以解决当前畜牧业中的呼吸道疾病问题。

在中国北方观察到的BRDC的多微生物性质与全球模式一致。英国最近的一项研究同样报告了77.6%的临床样本含有多种细菌物种，17.7%含有多种病毒，强化了共感染在全球BRDC表现中占主导地位的观点。值得注意的是，两项研究都确定M. bovis是混合感染中的核心参与者——在我们的队列中与P. multocida和M. haemolytica显著相关（表3），在英国队列中与P. multocida/Histophilus somni相关。这种在地理上不同的牛群中保守的模式强调了需要针对病原体协同作用而非单个因子的控制策略。

其在Q1和Q4的高季节性峰值（图7），结合中国北方冬季的冷应激和通风不良，有利于呼吸道病原体的传播。这得到了证据的支持，这些证据将低温归因于病毒稳定性增强和宿主免疫抑制。细菌阳性率全年保持稳定，表明环境持久性和管理相关因素（例如，运输应激）是关键因素。冬季BRDC发病率是夏季的2.3倍（内蒙古队列）反映了温带地区的发现，强调了季节性疫苗接种协议和改进饲养实践的必要性。

系统发育分析揭示了中国分离株与国际毒株之间的显著进化关系。例如，本研究中鉴定的BVDV亚基因型1a和1d（图5A）对应于北美和欧洲流行的谱系，突出了BRDC病原体的全球流通。BPIV-3c亚型的主导地位（图5B）与土耳其的最新报告一致，表明存在趋同进化压力。关于BRSV，基因型III的系统发育分类与先前中国分离株的报告一致。然而，与中国北方的历史毒株相比，当前的BRSV分离株在N基因序列上表现出2.1%的差异，可能表明存在局部进化适应。对于BHV-1，gB基因序列与Liu等人报告的国内毒株显示出>99%的同源性，表明该地区BHV-1的遗传稳定性。值得注意的是，未观察到与免疫逃避相关的新突变，这与欧洲新兴的BHV-1变种形成对比。这些发现强调了国际合作在病原体监测和疫苗开发中的重要性。

通过RT-qPCR检测到BVDV和BPIV-3的高检测率验证了分子诊断在BRDC管理中的实用性。然而，非致细胞病变BVDV毒株占主导地位，使及时诊断复杂化，需要进行血清学筛查以识别持续感染携带者。M. bovis检测从2022年到2024年的下降（图9B）可能反映了农场生物安全的改善，但其持续流行需要有针对性的抗菌药物管理以减轻耐药性。此外，P. multocida A型的鉴定（一种与严重肺炎病变相关的血清型）呼吁区域特异性菌苗配方。虽然本研究侧重于经典的BRDC病原体，但最近的证据表明，新兴病毒如流感D病毒（IDV）可能有助于中国北方的呼吸道疾病复合体。北美牛的研究报告称，IDV与BRSV和M. bovis在5.3%的BRDC病例中共检测，系统发育分析表明不同进化支之间存在重配。尽管此处未进行研究，但未来的监测应包括IDV，因为其在牛呼吸道疾病中的确认作用以及与本研究确定的优势病原体的潜在相互作用。

此外，我们关于细菌病原体（如M. bovis）中抗菌素耐药性（AMR）流行率升高的发现与最近的北美监测数据一致。据报道，来自背景饲养操作的肉牛与拍卖获得的犊牛相比，携带AMR细菌（例如，多重耐药Pasteurellaceae）的几率显著更高，这可能是由于在封闭的预饲喂场环境中长期接触抗菌药物。这强调了在中国北方的BRDC控制策略中，需要将管理实践（例如，最大限度地减少混合，优化背景饲养系统中的抗菌药物管理）与疫苗开发相结合。此类措施可能会减轻使BRD治疗复杂化的AMR菌株的出现。

虽然本研究提供了关键的基线数据，但有几个局限性值得考虑。首先，跟踪个体动物从出生到屠宰的纵向研究可以阐明时间感染动态。其次，未使用宏基因组测序来检测不可培养或新型病原体，可能低估了BRDC的复杂性。未来的工作应整合下一代测序以发现代表性不足的病原体。第三，对荷斯坦犊牛的关注可能限制了对其他品种或年龄组的普遍性。将监测范围扩大到包括肉牛和成年奶牛将增强流行病学相关性。

因此，在我们未来的研究规划中，我们将专注于BRDC病原体间协同感染的机制以及新型高效疫苗的开发。

结论

本研究描绘了中国北方BRDC的病原学全景，强调了病毒和细菌病原体之间的关系、气候和管理相关的应激源以及全球病原体流动性。与国际毒株的系统发育关系强调了跨境疾病监测的必要性，而季节性感染模式鼓励了响应性管理策略。通过将这些发现整合到区域疫苗接种计划、生物安全协议和抗菌药物指南中，利益相关者可以减少BRDC的经济和福利影响。未来的研究应专注于针对优势亚基因型的多价疫苗，并调查影响BRDC易感性的宿主遗传因素。