新型β-咔啉-{α-酰氨基酰胺}-双吲哚衍生物的一锅合成：抗菌评价、分子对接与密度泛函理论研究

本文报道了通过原子经济性的一锅Ugi四组分反应合成新型β-咔啉-{α-酰氨基酰胺}-双吲哚杂合分子（12a–l），并对其抗菌活性、分子对接和密度泛函理论（DFT）进行了系统研究。该研究针对多重耐药（MDR）菌株如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，发现多个化合物（如12b、12g和12h）表现出显著抗菌活性（MIC=302–303 μg mL?1），优于母体化合物（6和9）。分子杂交策略有效增强了抗菌效力，并通过分子对接揭示了与DNA旋转酶（DNA gyrase）的有利结合模式，DFT分析则支持了其电子反应性。该工作为开发新型抗菌剂提供了有价值的分子框架和理论依据。

　　

1 引言

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，尤其多重耐药（MDR）细菌对多种抗生素耐药，导致标准治疗失效。世界卫生组织（WHO）2024年细菌优先病原体清单（BPPL）列出了15个耐药菌家族，AMR预计到2050年每年可能导致1000万人死亡。耐药机制包括质粒介导的耐药基因获取、外排泵、细菌膜通透性降低、抗生素酶解和靶点结构修饰等。

杂环化合物在药物研发中具有重要地位，其中咔啉类作为含氮杂环天然产物，具有显著药理潜力。β-咔啉由三环吲哚与吡啶环稠合而成，根据A3环饱和程度分为不饱和（β-咔啉）、半饱和（3,4-二氢咔啉）和全饱和（1,2,3,4-四氢咔啉）。目前已发现140多种天然β-咔啉衍生物，如哈尔明碱和去甲哈尔明碱，最早从骆驼蓬中分离。β-咔啉具有抗氧化、抗焦虑、抗炎、抗抑郁、抗利什曼病、抗糖尿病、抗癌和抗菌等多种活性，并能与多种神经递质受体相互作用，以及介入DNA、抑制CDK和拓扑异构酶。

双吲哚甲烷（BIMs）同样具有广泛生物活性，如振动吲哚A（抗菌）、Arsiindoline A（抗癌）、Violacein（抗菌、抗真菌和抗癌）、Lynamicin B（杀虫）、星孢菌素（蛋白激酶抑制剂）和Flinderoles A（抗疟）等。此外，含羧酰胺基团的化合物具有镇痛、抗抑郁、止吐、抗精神病、抗病毒和抗菌活性，酰胺键增强代谢稳定性和药代动力学性质，α-酰氨基酰胺接头提供氢键潜力和分子柔性，已在抗菌肽模拟物开发中成功应用。

面对MDR病原体如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的威胁，设计将多个药效团整合到单一实体的杂交分子成为有前景的策略。分子杂交（MH）可增强生物活性、多靶点潜力和克服耐药性。近年来，分子杂交进展表明，组合两个或多个药效团可创建活性提升的单一实体，特别是涉及临床抗生素的杂交分子在增强疗效和克服耐药方面显示潜力。然而，针对抗菌活性的β-咔啉基杂交分子研究仍较少。

受上述药效团生物学意义启发，本研究旨在开发新型MH库作为潜在抗菌剂。这些杂交分子设计结合了β-咔啉和双吲哚甲烷的药效特征，两者均作为DNA旋转酶抑制剂具有强活性。该理性杂交方法旨在增强对多种革兰阳性和阴性微生物的抗菌效力。所有合成化合物均通过傅里叶变换红外光谱、NMR和质谱表征，并进行了分子对接研究以评估所选MH与细菌DNA旋转酶的相互作用，以及DFT计算以研究化合物稳定性概况和全局反应性参数。

2 结果与讨论

2.1 合成

中间体和目标化合物的合成路线如Scheme 1和2所示。首先，参照文献方法合成甲基-1-苯基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚-3-羧醛6和4-(二(1H-吲哚-3-基)甲基)苯甲酸9。前体I（6）的合成中，L-色氨酸1使用SOCl₂和干甲醇酯化得到L-色氨酸甲酯2，其与苯甲醛进行Pictet-Spengler环化形成四氢β-咔啉酯3作为非对映体混合物，直接用于完全芳构化产物4的制备，4经LiAlH₄还原得到相应甲醇5，最后通过Dess-Martin高碘烷（DMP）氧化制备前体I（6）。前体II（9）的合成涉及吲哚7与对甲酰基苯甲酸8的缩合反应。

2.2 目标分子杂交的优化研究

初步研究采用苯胺10、6、9和环己基氰11之间的模型反应制备MH 12a。对Ugi反应的溶剂和反应时间进行优化，结果总结于Table 1。优化研究表明溶剂选择显著影响产物收率。在极性质子溶剂中，甲醇和乙醇提供高达73%的收率，而水仅35%。极性非质子溶剂如乙腈和THF收率较低（16%和18%）。甲苯和二氯甲烷收率也较低。二元溶剂系统筛选显示，MeOH:CH₂Cl₂ (2:1)比例在16小时反应时间下获得最佳收率95%，表明甲醇富集环境增强溶解度和中间体稳定性。优化反应条件应用于制备杂交分子库12a–l（Scheme 3）。

2.3 光谱表征

所有合成杂交分子（12a–l）的结构通过FTIR、¹H和¹³C NMR及MS表征。以12a为例，其¹H NMR显示β-咔啉部分NH质子（H-57）在δ 11.45 ppm singlet，NH质子（H-12）在δ 10.87 ppm doublet，双吲哚单元CH质子（H-19）在δ 5.72 ppm singlet，环己基质子multiplet在δ 1.80–1.05 ppm。¹³C NMR显示两个酰胺羰基碳在δ 169.89 ppm（C-27）和δ 167.94 ppm（C-37），双吲哚部分C-19在δ 47.71 ppm，芳香碳在δ 145.60–111.28 ppm，环己基碳在δ 32.06–24.32 ppm。IR谱显示C=O吸收在ν 1631.66 cm^?1，NH吸收在ν 3270.55 cm^?1。MS显示分子离子峰m/z 823.9 [M+H]⁺，确认结构。

2.4 抗菌评价

通过Kirby-Bauer法琼脂扩散试验评估合成杂交分子的体外抗菌活性，针对革兰阳性和阴性细菌。使用两种革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和两种革兰阴性菌（铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌）筛选杂交分子12a–l的抗菌活性。初步研究（Table 2）显示合成杂交分子的抑制圈（ZI）介于4.3至22.6 mm之间。

最小抑菌浓度（MIC）值总结于Table 3。五个化合物12g、12h、12e、12d和12b对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌显示最高活性，MIC值302–308 μg mL^?1。三个化合物12a、12c和12f对相同两种菌株活性较低（MIC=617–621 μg mL^?1），四个化合物12i、12j、12k和12l活性非常低（MIC≥1172 μg mL^?1）。

针对鲍曼不动杆菌，三个化合物12b、12g和12h显示相同且最高效力，MIC值302–303 μg mL^?1，优于前体化合物I（6）（MIC=623 μg mL^?1）和II（9）（MIC=308 μg mL^?1），12h活性最佳。化合物12d和12e显示MIC 306–307 μg mL^?1，活性比前体I提高约一倍。化合物12i、12k和12l活性低。针对铜绿假单胞菌，12b、12e、12g和12h显示改进活性（MIC=302–306 μg mL^?1），优于前体I和II（623 μg mL^?1），12h最活跃。其余化合物MIC类似前体（617–625 μg mL^?1）。

针对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌，化合物12b在合成杂交分子中显示最高但弱活性（MIC=1242 μg mL^?1），优于前体I（6）（MIC=2476 μg mL^?1）但显著低于前体II（MIC=147 μg mL^?1）。所有其他化合物对该菌活性非常低或无活性（MIC≥1242 μg mL^?1）。针对枯草芽孢杆菌，化合物12b显示所有化合物中最高活性（MIC=303 μg mL^?1），优于前体I（MIC=2476 μg mL^?1）但不如前体II（MIC=146 μg mL^?1）。其余化合物显示类似弱活性，MIC≥1245 μg mL^?1。

化合物12g、12h和12b在革兰阴性菌株中显示最一致活性，支持组合β-咔啉、双吲哚和α-酰氨基酰胺药效团以增强抗菌效力的设计 rationale。观察到的与杂交支架假设的一致性，尤其针对革兰阴性菌，突显了整合多种相互作用模式到单一分子的优势。尽管所有类似物中未发现清晰趋势，但活性差异可能归因于结构变异。

2.5 构效关系（SAR）

合成β-咔啉-α-酰氨基酰胺-双吲哚杂交分子12a–l的构效关系分析显示，化合物12b、12g和12h表现出较高抗菌活性，尤其针对革兰阴性菌株如鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。化合物12g和12h在苯环上含强吸电子三氟甲基（–CF₃）基团，可能通过增加亲脂性增强细菌膜通透性和靶点结合。值得注意的是，化合物12b具有未取代苯环，也显示相当效力，突显杂交支架本身对生物活性的显著内在贡献。这表明即使缺乏电子修饰基团，杂交框架本身在驱动抗菌活性中起主导作用。此外，带环己基取代基的杂交分子通常优于带叔丁基基团者，可能由于在疏水酶口袋中改善容纳。针对鲍曼不动杆菌，苯环上含对三氟甲基、对氯、对甲氧基取代和未取代的化合物显示良好抗菌活性。针对铜绿假单胞菌（PAO1），带未取代苯环和叔丁基基团的化合物显示与带对三氟甲基和对甲氧基取代者相当活性。带未取代苯环和叔丁基基团的化合物对金黄色葡萄球菌最活跃。针对枯草芽孢杆菌，带未取代苯环和叔丁基基团的化合物显示所有衍生物中最高活性，而其他带对氯、对甲氧基、对三氟甲基、对甲基和对硝基苯环的化合物显示相当且显著较低活性。

2.6 对接研究

DNA旋转酶作为开发抗菌药物的关键治疗靶点，其在细菌中存在而在人类中缺失允许选择性抑制而不伤害宿主细胞。多个研究团队已发表关于含吲哚肽作为DNA旋转酶抑制剂的合成、表征和生物学评估信息。此外，β-咔啉的抗菌活性在文献中已有充分确立。因此，使用Schr?dinger套件（2022-1版）进行分子对接，计算基于OPLS4力场。首先从PDB下载DNA旋转酶晶体结构（PDB ID: 6KZV），并通过蛋白质纯化方法准备。在对接我们的化合物之前，通过重新对接结晶配体验证对接方案。原始配体的晶体学（绿色）和对接姿态（橙色）之间计算的均方根偏差（RMSD）值1.4 ?表明良好重现性，验证了对接方案。

2.7 对接结果

两个代表性化合物（12g和12h）对接在DNA旋转酶（PDB ID: 6KZV）活性位点以探索其结合取向，其对接复合物显示于Figure 6和7。每个蛋白质-配体复合物的最佳姿态基于对接分数、glide分数和XP能量选择（Table 4）。仔细检查这些图显示12g和12h在酶活性位点有效相互作用，由疏水和亲水氨基酸残基稳定。

化合物12h与Asp 73、Asp 49和His 83形成H键相互作用，键合距离分别为2.28、1.94和1.73 ?，显示化合物在酶活性位点内紧密结合。芳香环与Arg76氨基之间也观察到疏水π-阳离子相互作用。由于化合物12h大部分由芳香环组成，观察到该部分与周围残基的各种芳香-氢键相互作用，如与Glu50、Ala100、Gly 101和Asn 46（Table 4）。类似地，化合物12g显示与Val 43的H键相互作用（键合距离1.43 ?）和与Asn 46、Gly 113和Gly 77氨基酸残基的芳香-氢键相互作用。

2.8 DFT分析

利用DFT研究合成化合物的前沿分子轨道（FMO）和全局反应性。

2.9 结构优化能量

对系列中选定有效化合物（12g和12h）进行DFT研究以进行结构优化能量。应用B3LYP/6-31++G (d, p)方法进行DFT研究。化合物12g和12h的优化结构说明于Figure 8。

计算化合物的偶极矩和电子能量于真空介质，结果总结于Table 5。化合物12g和12h显示偶极矩分别为9.06和8.38 Debye。12g的较高偶极矩表明其比12h更极性。此外，12g和12h的优化能量分别为-3017.08和-2939.64 Hartree。

2.10 前沿分子轨道（FMO）分析

作为确定分子电子性质和化学稳定性的基本工具，FMO如最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）起关键作用。HOMO可定义为最高能量的松散结合电子轨道，而LUMO可定义为最低能量的未占电子轨道。识别这些轨道能量对于评估化合物的结构和反应性性质至关重要。因此，所有化合物的FMO计算在DFT水平进行，结果描绘于Table 6。预测化合物12h（E_HOMO = -3.11 eV）具有较高的HOMO能量以及LUMO能量（E_LUMO = -2.50 eV）。能隙定义为HOMO和LUMO能量之间的差异，较小隙指示更大反应性，而较大隙指示更大稳定性。化合物12h具有较低能隙（ΔE = 0.60 eV），预测更具反应性。此外，这些化合物中HOMO和LUMO的电荷密度分布在整个分子上，如Figure 9所示。

2.11 全局反应性性质计算

Table 7展示了最活跃化合物12g和12h的全局反应性参数，如电离势（I）、电子亲和势（A）、硬度（η）、电负性（χ）、软度（S）、化学势（μ）和亲电性指数（ω）。

分子特征在于其电离势（I）和电子亲和势（A），分别反映失去和获得电子的能力。较低电离势意味着更容易移除电子，而较高电子亲和势指示更大接受电子倾向。因此，预测具有较低I值（I = 3.11 eV）的化合物12h是较强碱，而具有较高A值（A = 0.72 eV）的化合物12g是较强亲电体。电负性（χ）显示分子吸引电子朝向自身的潜力。化合物12g（1.63 eV）显示最高电负性 compared to 12h。化学势（μ）与电负性（χ）相关，测量分子内电子相互吸引的倾向。化合物12g（-1.63 eV）显示较低化学势相对于12h。

全局硬度（η）测量分子对电荷转移的抵抗，而全局软度（S）指示其促进电荷转移的倾向。优选分子具有较低全局硬度和较高全局软度，因为这些性质增强分子将电荷转移至相邻生物分子的能力，从而改善分子相互作用。计算发现化合物12h（η = 0.30 eV and S = 0.33 eV^?1）显示与附近分子或生物分子更好相互作用 compared to 12g。

亲电性指数指吸引电子的能力，反映当分子与附近环境中电子相互作用时稳定所需的能量。计算结果表明化合物12h（4.22 eV）具有较高亲电性指数。

3 结论

总之，通过一锅Ugi反应合成新型β-咔啉-{α-酰氨基酰胺}-双吲哚杂交分子12a–l系列，并针对革兰阳性和阴性菌株进行抗菌活性测试，随后进行计算研究。其中，化合物12g、12h和12b表现出显著活性，尤其针对MDR革兰阴性菌株。尽管观察到活性中等，但相对于前体化合物的持续增强表明分子杂交在改善抗菌效力方面的潜力，尤其针对革兰阴性菌株。12g、12h和12b的生物学性能得到分子对接和DFT研究进一步支持，指示有利结合相互作用和电子特性。除生物学效力外，采用的合成策略高度成本效益和操作简单，利用一锅多组分协议在温和条件下进行。该方法最小化纯化步骤，减少合成努力，并缩短总体过程 compared to 逐步合成。它还减少废物和反应时间，并促进重现性和可扩展性，使其成为快速生成多样分子支架的有吸引力路线。虽然活性中等，但杂交支架呈现新颖框架，可作为未来抗生素开发优化的基础。本研究主要关注杂交分子的合成和抗菌筛选针对革兰阳性和阴性细菌。未来工作可能包括毒理学评估和环境安全性研究以进一步探索这些化合物的潜力。