人源PCMTD1-CRL5复合物识别L-异天冬氨酰损伤蛋白的结构基础揭示新型蛋白质质量控制机制

本研究针对衰老过程中自发形成的L-异天冬氨酰(L-isoaspartyl)蛋白质损伤积累问题，通过冷冻电镜和天然质谱技术解析了人源PCMTD1-CRL5 E3泛素连接酶复合物的结构机制，发现该复合物在AdoMet存在下特异性识别L-isoaspartyl修饰，为蛋白质质量控制提供了全新的降解途径，揭示了E3连接酶识别非酶促翻译后修饰的新范式。

　　

随着机体衰老，蛋白质会自发发生多种化学修饰，其中L-异天冬氨酰(L-isoaspartyl)残基的形成是一种主要损伤类型。这种修饰会导致多肽链扭曲，破坏蛋白质结构稳定性，进而影响蛋白质功能。长期以来，蛋白质L-异天冬氨酰甲基转移酶(PCMT1)介导的修复机制被认为是细胞应对这种损伤的主要方式。然而，越来越多的证据表明，可能存在另一种通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)清除损伤蛋白的替代途径。

在这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，Eric Z. Pang等研究人员深入探讨了人源PCMTD1蛋白在识别和清除L-异天冬氨酰损伤蛋白中的作用机制。PCMTD1是一种含有PCMT样结构域的cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)组分，虽然能结合甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)，但缺乏甲基转移酶活性。

研究人员综合运用冷冻电镜(cryo-EM)、天然质谱(nMS)和生物化学分析等技术，系统研究了人源PCMTD1在CRL复合物上下文中的组装方式和结构特征。研究发现PCMTD1通过与Elongin B/C(ELOBC)和CUL5-RBX2形成五聚体CRL5-PCMTD1复合物，该复合物呈现出典型的马蹄形结构，跨度达165埃。

关键技术方法包括：通过体外重组表达和纯化获得蛋白复合物；利用冷冻电镜解析复合物高分辨率结构；采用天然质谱分析复合物组装状态和底物结合特性；使用紫外交联实验验证AdoMet结合能力；通过免疫共沉淀和质谱鉴定细胞内相互作用蛋白。

研究结果部分：

人类PCMTD1组装成cullin-RING连接酶复合物

研究人员发现CRL5-PCMTD1复合物由PCMTD1、ELOB、ELOC、CUL5和RBX2各一个亚基组成，形成稳定的五聚体结构。冷冻电镜分析显示该复合物具有典型的CRL马蹄形架构，其中底物受体复合物(SRC)和cullin支架两个区域清晰可辨。

PCMTD1通过经典和独特的SOCS-box相互作用结合cullin-RING连接酶组件

结构分析表明，PCMTD1通过其C端的BC-box和Cul-box基序分别与ELOC和CUL5相互作用。与大多数SOCS-box蛋白不同，PCMTD1的BC-box和Cul-box之间由一个较长的89个氨基酸残基连接区(BC-Cul linker)分隔。PCMTD1与ELOC的界面延伸约35埃，比类似复合物ASB9-ELOBC的界面长约15埃。

PCMTD1的N端结构域拓扑结构与PCMT1蛋白修复甲基转移酶相似

PCMTD1采用双结构域结构，包含N端7β链甲基转移酶(7βS MTase)结构域和C端扩展SOCS-box(ESB)结构域。虽然整体折叠与PCMT1相似，但PCMTD1在β链7后有一个新颖的突出环，并且其中心β片层中含有一个功能未知的Met-Cys-Met簇。

PCMTD1以AdoMet依赖性方式特异性结合含L-异天冬氨酰的底物

天然质谱分析显示，PCMTD1-CUL5tet复合物能够特异性结合含L-异天冬氨酰的肽段和蛋白质，而不识别正常L-天冬氨酰形式的肽段。重要的是，这种结合严格依赖于AdoMet的存在，但AdoMet并不作为甲基供体，而是起到稳定复合物与底物结合的作用。

PCMTD1可能由于AdoMet和异天冬氨酰α-羧基的相对位置而缺乏甲基转移酶活性

结构比较发现，PCMTD1中苏氨酸到组氨酸的替换阻断了AdoMet与底物之间的通道。这种组氨酸选择似乎通过与异天冬氨酰残基的α-羧基形成盐桥而实现，同时阻止了羧基接近AdoMet的甲基基团。

Nedd化可能诱导CRL5-PCMTD1复合物的构象变化

研究发现nedd化修饰可能引起CRL5-PCMTD1复合物从延伸状态向更紧凑的构象转变， termini间距从165埃缩短到150埃，SRC顺时针偏转约30°，这种构象变化可能激活复合物的泛素化功能。

研究结论和讨论部分强调，这项工作揭示了CRL5-PCMTD1通过识别自发形成的L-异天冬氨酰损伤而靶向底物进行泛素化降解的新机制，为理解年龄相关蛋白质损伤的调控提供了重要见解。与修复酶PCMT1不同，PCMTD1采用完全不同的策略——通过泛素-蛋白酶体系统直接清除损伤蛋白，这两种机制可能共同协作维持蛋白质稳态。

特别值得注意的是，PCMTD1对L-异天冬氨酰的识别需要AdoMet的参与，这提供了代谢与蛋白质质量控制之间的潜在联系。同时，nedd化修饰可能作为调节该复合物活性的另一种机制。这些发现不仅拓展了对E3泛素连接酶底物识别机制的理解，也为开发针对年龄相关蛋白质聚集疾病的治疗策略提供了新的思路。

人类拥有PCMTD1的旁系同源物PCMTD2，两者氨基酸序列约68%相同，很可能具有类似的生理功能。这意味着细胞可能通过PCMT1、PCMTD1和PCMTD2的协同作用，针对不同的蛋白质底物群体有效缓解L-异天冬氨酰损伤的积累。