综述：环氧二十碳三烯酸生物作用的推定受体和信号通路

本综述系统探讨了环氧二十碳三烯酸（EETs）这一内源性信号分子的复杂作用机制。文章重点聚焦于其通过G蛋白偶联受体（GPCR）如GPR40、GPR132、GPR39以及血栓烷受体（TP）和前列腺素E2受体（EP）等介导的多种生理效应（如血管舒张、抗炎），同时也涵盖了其不依赖于GPCR的替代信号通路（如直接激活PPARs、TRP通道和KATP通道），全面评估了其巨大的治疗潜力及当前研究的挑战。

　　

引言

环氧脂肪酸（EpFAs），包括来源于花生四烯酸（AA）的环氧二十碳三烯酸（EETs），是一类内源性产生的生物活性信号分子，具有多样的生理效应，如血管舒张、抗炎和心脏保护作用。EETs由特定的细胞色素P450（P450s）生成，其生物活性可被环氧化物水解酶（如可溶性环氧化物水解酶sEH和微粒体环氧化物水解酶mEH）通过水解成活性较低的二元醇（DHETs）而减弱。在临床前疾病模型中，抑制sEH已显示出显著的治疗前景。尽管EETs具有深远的生理影响且sEH抑制剂拥有治疗潜力，但EETs引发其生物效应的精确信号机制仍属未知。许多研究试图鉴定出一个高亲和力的、EET激活的G蛋白偶联受体（GPCR）。本综述综合了当前关于支持一种或多种EET-GPCRs存在的证据，并权衡了这些证据与其他替代或互补的EET信号通路。这些研究的广度凸显了全面阐明EET作用精确分子机制的复杂性与挑战。

Evidence for an EETR

血浆中非酯化的单个EETs浓度较低（约1-10 nM），而在组织中浓度高出10倍。EETs在低至1-100 nM的浓度下即可在体内、体外和离体实验中触发生理效应，包括血管舒张、抗炎、支气管扩张和血管生成。脂质信号分子可以通过GPCRs进行信号传导。例如，前列腺素、P450和脂氧合酶衍生的羟基二十碳三烯酸（HETEs）、脂氧素、白三烯以及专门的促消退介质已被报道有高亲和力的GPCRs。然而，国际基础与临床药理学联合会（IUPHAR）对于认可配体/GPCR对有着严格的标准。迄今为止，IUPHAR仅正式认可了多种前列腺素和白三烯与同源受体的高亲和力相互作用，以及12-HETE与GPR31的相互作用。尽管有许多提示性研究，IUPHAR尚未正式认可大多数HETEs或任何SPMs或EpFA的受体。

配体与GPCRs结合诱导GTP加载、激活以及Gα亚基从受体上解离。激活单个受体可通过在不同细胞类型中偶联不同的α亚基导致多种结果。四种Gα亚型诱导多种细胞反应：Gα_s亚基刺激腺苷酸环化酶（AC）诱导cAMP形成和PKA激活；Gα_i亚基抑制AC并诱导cGMP磷酸二酯酶；Gα_q/11亚基激活磷脂酶C并增加细胞内钙；Gα_12/13亚基可激活Rho家族GTPases。Gβγ亚基也激活信号通路，如细胞外调节激酶（ERK）通路。考虑到EETs与其他已知GPCR配体的结构相似性及其在体外刺激许多GPCR通路的能力，EETs作为配体反式激活一个或多个GPCRs以诱导下游信号似乎是合乎逻辑且可能的。

EETs已显示出提示其激活GPCR信号传导的特异性效应。EETs表现出高亲和力的膜结合，诱导Gα_s GTP加载，反式激活cAMP诱导，并通过PKA调节次级效应。1997年，Wong及其同事首次在单核细胞膜中鉴定出14,15-EET的高亲和力结合位点。放射性标记的14,15-EET研究显示，在U937细胞中的半最大结合浓度（Kd）为14 nM，在原代猪单核细胞中为35 nM。EETs在单核细胞中激活cAMP，但此效应需要超生理（微摩尔）水平的14,15-EET。使用涂有交联14,15-EET的硅珠证明了EETs的细胞外结合位点。尽管无法穿过细胞膜，硅珠连接的14,15-EET抑制双丁酰-cAMP诱导的芳香酶活性的程度与游离的11,12-或14,15-EET相似。EETs需要Gα_s的ADP-核糖基化来激活血管K_ATP通道。Li等人还确定EETs通过Gα_s信号传导调节平滑肌松弛。他们证明11,12-EET诱导的大电导Ca²⁺激活钾通道（BK_Ca）激活需要Gα_s的GTP加载和PKA的激活。这种信号传导由低纳摩尔浓度的11,12-EET诱导。所有这些数据都表明存在一个EET反应性GPCR的结合和激活。

EETR screening efforts

多个实验室尝试了不同的方法来鉴定推定的EETR（EET受体）。揭示直接EETR结合的方法包括将膜或细胞与标记的EETs（如生物素化、光亲和交联或放射性标记的EETs）一起孵育。另一种检测直接受体相互作用的方法涉及通过添加EETs来置换已知配体，或用已知配体置换EETs。鉴定EETR的间接方法包括转染克隆的GPCRs或使用GPCR抑制剂，并结合检测cAMP形成、钙内流、ERK激活、离子电流、β-抑制蛋白转运或动脉血管舒张。虽然间接方法在高通量筛选 assay 中可能有优势，但必须通过直接结合 assay 来确认，以确定EETs作为推定性GPCRs配体的亲和力。

已有几个不成功的EETR克隆努力的例子被发表。鉴于对发表阴性结果的偏见，很可能其他不成功的克隆尝试未被报道。2007年，Hammock实验室与CEREP实验室签约，评估EETs是否能在一系列43个与疼痛感觉相关的GPCRs中置换已知的配体/受体相互作用。其中，发现EETs能置换外周苯二氮卓受体、大麻素CB₂受体、神经激肽NK₂受体和多巴胺D₃受体的配体；然而，置换需要>10 μM的EETs。作者得出结论，这些受体都不太可能是高亲和力的EETR。2011年，Chen等人报道使用一种放射性标记的光亲和EET化合物，该化合物可通过紫外光激活以交联到相邻蛋白质。作者在来自兔、人和牛动脉的平滑肌细胞和内皮细胞中检测到该化合物与一个47 KDa蛋白质的交联。加入8,9-、11,12-或14,15-EET可防止交联。47 kDa是GPCR的常见大小；然而，作者未能鉴定出被标记的蛋白质。他们通过将80个孤儿受体转染到HEK293细胞中来追踪这一发现；然而，他们未能重现与任何这些受体的特异性交联。我们的实验室与北卡罗来纳大学的Roth实验室签约，该实验室可以使用PRESTO-Tango技术筛选GPCRs的激活。该筛选未能使用1 μM浓度的8,9-、11,12-和14,15-EET检测到347个GPCR中任何一个的激活；然而，这些方法可能不是鉴定氧脂素受体的理想方法，因为它们也未能将GPR75鉴定为20-HETE受体。

GPCR生理学的几个方面使得鉴定推定的EET受体具有挑战性。例如，一些激动剂仅激活作为异源二聚体存在的GPCRs。鉴定一个仅作为异源二聚体最小功能单元起作用的EET敏感GPCR，需要恰好筛选表达足够量异源二聚体伙伴的单转染细胞。类似地，一些GPCRs与受体活性修饰蛋白（RAMPs）相互作用，RAMPs与GPCRs相互作用以修改其功能。与不同RAMPs的结合可以调节GPCRs对配体的敏感性，从而以受体依赖的方式改变信号传导和/或运输。此外，试图通过EET敏感细胞类型的RNA表达谱来推断EETR可能会因为存在一个能够对EETs作出反应的受体家族而混淆；没有一个单一基因必然在每个EET敏感细胞系或细胞类型中表达。EETs也可能间接调节GPCRs，其方式类似于最近发现消退素通过变构修饰PGE₂在EP4受体上的活性而具有抗炎活性。最后，虽然假定游离的、非酯化的EETs是推定的信号分子，但替代的环氧化物代谢物，如环氧内源性大麻素，受类似的P450和环氧化物水解酶途径调节，并可能具有独立或重叠的效应。

Identified EETR activities

GPR40/GPR120 Agonist

许多研究通过GPCR依赖机制鉴定了EpFA结合或活性。首次提及EET反式激活已知GPCR是在2003年，Itoh及其同事发现游离脂肪酸通过GPR40调节胰岛素分泌。虽然不清楚他们筛选了多少脂肪酸和氧脂素，但他们报道11,12-EET和14,15-DHET在GPR40转染的CHO细胞中以EC50分别为1.4 μM和1.1 μM增加细胞内钙水平。5,6-和8,9-EET效力较低，分别以7.7 μM和6.1 μM的EC50增加钙水平。11,12-EET与二十二碳六烯酸（DHA）效力相当，而AA以2.4 μM的EC50激活GPR40。一个GPCRs家族已知被多种游离脂肪酸激活，因此被称为游离脂肪酸受体（FFARs）。GPR40也被称为FFAR1。

随后，Ma等人证明11,12-和14,15-EET都能在GPR40转染的细胞中反式激活ERK通路。在他们的系统中，GPR40被建议激活一个脱落酶，该酶释放肝素结合的表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）以激活EGF受体（EGFR）。这些研究需要相对高水平的EETs，因为在低于5 μM的任一EET时均未观察到ERK磷酸化。Park等人也证明了在转染了GPR40的HEK细胞中的EET信号传导。11,12-和14,15-EET都在低于1 μM的剂量（分别为0.91 μM和0.58 μM）下增加细胞内钙水平。11,12-和14,15-EET的信号传导明显强于5,6-或8,9-EET、11,12-或14,15-DHET以及二十碳五烯酸（EPA）环氧化物17,18-EpETE。重要的是，这些作者通过显示置换已知的GPR40激动剂TAK-875证明了直接结合到受体。8,9-、11,12-和14,15-EET也在转染了GPR120（FFAR4）的HEK细胞中增加钙水平；然而，GPR120激活需要显著更高水平的这些EETs（5-10 μM）。虽然GPR40似乎在胰腺中表达最丰富，但该研究证明了GPR40和GPR120在内皮细胞和平滑肌细胞中都有表达。

总之，多个独立小组已证明EETs具有GPR40激动剂活性。GPR40在EET敏感细胞类型中表达，如内皮细胞、平滑肌细胞和胰腺细胞。EETs被显示直接结合GPR40；然而，估计的500 nM-5 μM的Kd范围表明，GPR40和GPR120都不是高亲和力的EET受体。鉴于大多数触发EETs释放和/或形成的刺激也会释放更大量的许多游离脂肪酸，EETs在体内对GPR40或GPR120信号传导的贡献程度仍不清楚。尽管如此，GPR40信号传导在许多血管表型中与EET信号传导平行。GPR40信号传导诱导血管生成，是抗伤害性的，通过抑制NF-κB减少炎症，防止神经退行性变，并保护心脏免受缺血-再灌注损伤。由于GPR40信号传导可以诱导选择性的、配体依赖的替代通路激活，辨别EET通过GPR40受体在体内信号传导的作用可能很复杂。

GPR132 Agonist

Lahvic等人在发现11,12-EET在斑马鱼移植模型中促进造血干细胞植入后，筛选了EET敏感的GPCRs。使用混合β-抑制蛋白招募系统筛选GPCR转染的细胞，他们发现11,12-EET激活GPR132，导致其磷酸化和β-抑制蛋白招募。发现GPR132被11,12-EET和11,12-DHET激活，但EC50相对较高，为2-10 μM。GPR132被测试对多种氧脂素和脂肪酸的反应，并发现被9-HODE最强激活，这与之前的研究相似。11,12 EET在此系统中激活GPR132的程度与AA相同。考虑到11,12-EET相对于9-HODE和AA的相对丰度，这些数据表明GPR132在体内最不可能主要对EETs作出反应。由于GPR32被多个氧脂素和脂肪酸激活，它现在被认为是FFAR超家族中一个不太明确的成员。

GPR39 Agonist/Antagonist

14,15-EET最近被鉴定通过一种与上述相似的14,15-EET光亲和探针结合GPR39。Alkayed等人证明14,15-EET仅在GPR39转染的HEK293细胞中诱导ERK磷酸化。14,15-EET诱导的ERK激活被1 μM锌增强一个数量级。11,12-、8,9-和5,6-EET在GPR39转染的细胞中均未显示任何活性。对接模拟成功识别出15-HETE也可能结合GPR39。在锌存在下，14,15-EET和15-HETE都通过GPR39反式激活ERK信号传导，EC50小于100 nM。野生型和GPR39敲除心脏的离体冠状动脉灌注实验揭示了14,15-EET、15-HETE和GPR39之间的复杂相互作用。1 μM 15-HETE在野生型小鼠心脏中诱导冠状动脉血管收缩和升高冠状动脉灌注压。15-HETE诱导的冠状动脉灌注压升高在GPR39缺陷小鼠中被消除。14,15-EET本身显然对冠状动脉张力没有影响；然而，14,15-EET拮抗了15-HETE诱导的冠状动脉血管收缩。鉴于GPR39对14,15-EET具有不寻常的选择性和反应，作者得出结论，GPR39不是单一的高亲和力EET受体；然而，它可能属于一个EET受体家族，EETs通过它们发挥其生理效应。

GPR39缺陷小鼠的实验提示GPR39与EET信号传导有许多相似之处。虽然增强EET信号传导改善小鼠中风模型中的微血管流量和脑结局，但GPR39无效小鼠在实验性中风后具有更严重的脑损伤、微血管灌注和神经功能。相反，GPR39缺陷小鼠对炎症性结肠炎的敏感性增加，并且葡萄糖耐量、胰岛素分泌和伤口愈合受损。GPR39缺陷小鼠的这些效应在很大程度上与通过增强EET信号传导所见效应相反，这表明GPR39仅介导体内发生的一些EET信号传导。

Thomboxane Receptor Antagonist

几份报告表明EETs可能作为血栓烷受体（TP受体）的选择性拮抗剂。两个小组报道EETs可以松弛用TP激动剂U46619预收缩的动脉。2009年，Behm等人发现EETs可以松弛用TP受体激动剂U-46619预收缩的大鼠主动脉或小鼠肠系膜动脉，但不能松弛用去氧肾上腺素、内皮素-1或氯化钾预收缩的动脉。8,9-和11,12-EET是最有效的氧脂素，在0.6 μM的浓度下诱导50%松弛（IC50）。14,15-EET效力稍低，IC50为0.8 μM。8,9-和14,15-DHET证明的松弛作用显著低于其相应的EETs；然而，11,12-EET和11,12-DHET诱导了U46619预收缩动脉的类似松弛。这种氧脂素效力模式几乎完全匹配这些氧脂素在松弛人类冠状动脉中的效力。14,15-EET也能减弱U46619介导的大鼠三级支气管收缩。重要的是，作者证明14,15-EET可以以3.3 μM的IC50置换放射性标记的SQ-29548（一种TP激动剂）的特异性结合。14,15-EET也能置换来自PGF_2α受体（FP，IC50 5.3 μM）和PGD₂受体（DP，IC50 6.1 μM）的放射性配体。14,15-EET在浓度低于10 μM时不能置换前列环素、PGE₂或白三烯受体（分别为IP、EP1-4、BLT2、CysLT1-2）的放射性配体。Malacarne等人在检查小鼠主动脉反应时发现了类似的发现；微摩尔浓度的11,12-EET可以松弛用U46619预收缩的主动脉，但不能松弛用去氧肾上腺素预收缩的主动脉。Senouvo等人也发现U46619预收缩的支气管可以被14,15-或8,9-EET在浓度分别为0.1-1 μM或>1 μM时松弛。

三个独立实验室报告了TP激动剂预收缩的动脉或支气管的选择性松弛，这暗示EETs作为选择性TP受体拮抗剂发挥作用。虽然这些发现是明确的，但EETs在体内作为TP拮抗剂的程度尚不清楚。EETs或sEHi在一些不主要依赖于血栓烷诱导血管收缩的模型中松弛血管和/或降低血压。TP受体拮抗也很有趣，因为它也可以部分解释EETs抗炎作用的基础机制。TP受体在整个心血管系统中广泛表达；然而，相对低亲和力的血栓烷-TP-受体相互作用的拮抗不太可能介导许多其他EET介导的效应，包括它们的血管生成、促有丝分裂、促迁移、抗凋亡和细胞保护特性。

PGE₂ Receptor Agonist

多份报告表明EETs可能通过PGE₂受体起作用。4个已确立的PGE₂受体通过不同通路起作用。EP2和EP4刺激cAMP和PKA，而EP4也反式激活PI3K和ERK信号传导。EP1激活PKC并增加细胞内钙水平，EP3抑制cAMP形成。如上所述，Behm等人确定EETs对所有4种EP受体的亲和力低（> 10 μM）。相反，Liu等人报道了将GPCRs转染到青蛙卵母细胞中的广泛筛选结果，该筛选使用基于检测囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）反式激活的报告信号。EP2、EP3、EP4、FP和DP受体都对1 μM 14,15-EET产生反应，但只有EP4对低至100 nM的14,15-EET有反应。在后续实验中，表达EP2和EP4的HEK293细胞在用1 μM 14,15-EET处理后显著增加ERK磷酸化。相反，FP-、DP-和EP3转染的细胞未能响应14,15-EET激活ERK。EET反应不被吲哚美辛阻断，这表明EP2和EP4反应是直接相互作用，而不是次级于EET刺激的前列腺素形成。

EP受体在调节EETs效应中的潜在作用得到了额外研究的支持。Yang等人证明，用去氧肾上腺素预收缩的大鼠肠系膜动脉可以被14,15-EET松弛。虽然这些松弛需要高EET水平（～10 μM 14,15-EET），但EET诱导的松弛被EP2受体拮抗剂AH6809显著抑制，而不被EP1、EP3、EP4拮抗剂抑制。此外，14,15-EET与大鼠平滑肌细胞的特异性结合在用EP2特异性siRNA预处理的细胞中显著减少。在一项单独的研究中，14,15-EET诱导肠系膜动脉松弛的能力在老年小鼠的动脉中降低。这一发现与小鼠随着年龄增长肠系膜动脉EP2受体表达减少同时发生。无论年龄大小，EP2拮抗剂都能够降低14,15-EET松弛预收缩肠系膜动脉的能力。

Matsumoto等人研究了几种细胞类型中一组氧脂素诱导cAMP形成的情况。他们发现1 μM浓度的14,15-和11,12-EET、8,9-DHET、两种EpOMEs和AA最一致地在HEK293、人类冠状动脉平滑肌（HCASMC）和LLC-PK1细胞中诱导cAMP形成。在HEK293和LLC-PK1细胞中，EET诱导的cAMP形成可以被EP2受体拮抗剂TG6-10-1强烈逆转，而EP4受体拮抗剂几乎没有效果。相反，在可能缺乏EP2和EP4受体的HCASMC中，两种拮抗剂都不能逆转EET诱导的cAMP形成。有趣的是，HCASMC中8,9-DHET诱导的cAMP形成被前列环素受体（IP）的siRNA敲减所减弱。AA诱导的cAMP形成可以被COX-2抑制剂双氯芬酸强烈抑制，这表明AA本身不是信号配体，而是被转化为一个或多个前列腺素来诱导信号转导。EET和EpOME诱导的cAMP形成也基本上被双氯芬酸减少；因此，EET反式激活EP2受体是通过直接与受体相互作用还是通过形成PGE₂或其他作为第二信使的前列腺素仍不清楚。

Nagarajan等人还在转染到HEK 293细胞中的111个GPCRs组中鉴定了一个PGE₂受体（EP4），并筛选了1 μM 14,15-EET诱导的ERK激活。EP4是这个 assay 中最强的命中；然而，它仅略优于其他报道的命中，这些命中包括CCR3、GPR85、GPR17、CXCR4、PAR1、GPR31、IP和GPR63。作者没有评估直接的EET-受体结合，也没有探究EETs是否触发了这些受体的已知配体的释放，这些配体包括趋化因子如嗜酸细胞活化趋化因子、RANTES、MCP-3/4和CXCL12，以及脂质如12(S)-HETE、PGI₂、LTC₄和S1P。尽管如此，这些作者提供了一个有趣的列表，应该独立验证其对EET诱导的体外信号传导和体内生理学的调节。

Other EpFA-activated GPCRs

最丰富的EPA衍生的EpFA，17,18-环氧二十碳四烯酸（EpETE），最近被鉴定为鞘氨醇-1-磷酸受体-1（S1PR1）的配体。17,18-EpETE从S1PR1上置换[³H]-S1P，并在体外显示出有效的效应，在10-100 nM调节钙内流和内皮激活。重要的是，17,18-EpETE在体内减弱动脉粥样硬化发展的能力在S1PR1缺陷小鼠中被消除。作者排除了GPR132和GPR120参与17,18-EpETE活性；然而，他们没有检查EETs是否激活S1PR1。有趣的是，EETs先前被证明激活鞘氨醇激酶，这是产生S1P的酶。因此，存在一种可能性，即EpETE和S1P在S1PR1上发生复杂的协同作用。虽然EET反式激活S1PR1仍然是可能的，但之前的一项研究表明EET和EpETE信号传导可能是不同的；14,15-环氧二十碳-5(Z)-烯酸（EEZE），一种推定的EET受体拮抗剂，未能阻断17,18-EpETE诱导的血管舒张。17,18-EpETE也被报道反式激活GPR40和GPR120以调节接触性超敏反应；然而，这些研究表明这些是较低亲和力的相互作用，EC50s分别为>2 μM和>10 μM。

最丰富的DHA衍生的EpFA，19,20-环氧二十二碳五烯酸（EpDPA），似乎通过FFARs GPR40和GPR120起作用。Aoki等人报道19,20-EpDPA减轻非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和肝纤维化，这种效应可以被GPR120拮抗剂逆转。19,20-EpDPA在GPR40和GPR120转染的细胞中都激活了TGFα脱落，尽管最大效应出现在大多数被测氧脂素（包括omega-3二元醇）都有一些效应的浓度范围（10-33 μM）。19,20-EpDPA在330 nM浓度下最强地激活GPR40，尽管只有GPR120抑制剂或Gpr120基因破坏改变了19,20-EpDPA减轻NAFLD的能力。需要更详细的受体结合动力学和后续实验。

Effective low-affinity interactions

虽然其他类EET脂质已知通过高亲和力GPCRs发出信号，但存在高亲和力、EET敏感GPCR的可能性仍然存在。在体内，EETs可能通过较低亲和力的相互作用在高局部EET浓度的情况下有效反式激活GPCRs，通过EETs的协调释放。我们对EETs如何形成和运输以诱导受体信号传导的理解是不完整的；然而，体内EET形成和处理可能与前列腺素有显著不同。产生前列腺素的环加氧酶和合酶以及产生EETs的P450s主要局限于内质网。一旦形成，前列腺素或游离EETs可以被脂肪酸结合蛋白和脂质转运蛋白结合，以保护它们免于降解和/或促进细胞外流出。有趣的是，虽然大多数前列腺素结合GPCRs上的细胞外位点，但脂肪酸与GPR40的结合位点最近被提出位于跨膜部分，位于脂质双层内并与脂质双层的胞质面相邻。14,15-EET与GPR39的结合也被模拟发生在跨膜位点。像许多氧脂素一样，细胞中的大多数EETs被酯化到膜磷脂的sn-2位。酯化的EETs可能分布在整个细胞膜中，并且可以被相同的刺激和释放AA的PLA₂酶优先释放。目前尚不清楚EET信号传导是直接发生在EET形成之后，还是发生在PLA₂介导的释放之后。结合位点甚至可能最好从膜胞质侧释放的AA访问。因此，仍然存在一种可能性，即酯化的EETs可以从血浆膜磷脂中释放，在EET敏感GPCRs附近产生非常高的局部浓度。

Non-EET-selective GPCR Signaling Mechanisms

Indirect Receptor Crosstalk

脂质受体的反式激活并不罕见。例如，成纤维细胞在拉伸松弛后cAMP的形成已被追溯到TRPV4通道的激活、细胞内钙的增加、PLA₂的激活、AA的释放和COX依赖的前列腺素信号传导。虽然多位研究者提出了前列腺素受体在EET信号传导中的作用，但关于EETs是直接还是通过COX依赖的前列腺素形成反式激活EP、DP、FP或IP受