基于综合征候群策略快速检测与鉴别人类致病性甲病毒的多重实时RT-PCR技术开发及验证

本刊推荐：为解决虫媒病毒（arboviruses）尤其是甲病毒（alphaviruses）因诊断资源有限导致的漏检与误诊问题，研究团队开发了一种新型多重实时逆转录PCR（RT-PCR）检测技术。该技术通过单次反应即可同步检测并鉴别除巴马森林病毒（BFV）外的所有常见人类致病性甲病毒抗原复合群，其灵敏度显著优于既往方法，且适用于资源有限地区。研究成果为甲病毒的全球监测和临床精准诊断提供了高效、可靠的解决方案，对提升新发传染病应对能力和公共卫生决策水平具有重要意义。

　　

在全球范围内，由蚊、蜱等节肢动物传播的病毒（简称虫媒病毒，arboviruses）正带来日益沉重的公共卫生负担。据估计，约有39亿人面临虫媒病毒感染的风险，而气候变化和媒介生物分布范围的扩大，很可能使这一数字继续攀升。在众多虫媒病毒中，除了人们较为熟悉的登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）等黄病毒（flaviviruses），甲病毒（alphaviruses）同样是重要的致病元凶，其中基孔肯雅病毒（CHIKV）尤为突出，其传播范围几近全球，仅在2023年，美洲地区报告的感染病例数就超过了40万。

然而，对大多数虫媒病毒的流行病学、致病机制及其真实的公共卫生负担，我们的认知仍然非常有限。这很大程度上是由于在许多地区，受资源所限，无法开展全面、彻底的实验室检测。甲病毒的诊断面临着特殊的挑战：其感染后的临床症状往往非特异（如发热、皮疹、关节痛），与登革热等疾病相似；病毒血症期短暂；加之抗原性相近的病毒可能存在共循环的情况，这些都给准确诊断带来了困难。目前的实验室诊断通常只覆盖最常见病原体（如DENV和CHIKV），导致许多其他甲病毒感染被漏诊或误诊。例如，在巴西，通过回顾性的针对性RT-PCR检测，发现了此前未被识别的马亚罗病毒（MAYV）感染；在多个拉丁美洲国家，表现为登革样疾病的委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）感染也是通过针对性检测才得以诊断；在乌干达，回顾性血清学调查则揭示了奥尼翁尼翁病毒（ONNV）感染的严重漏报情况。对除DENV或CHIKV以外的大多数虫媒病毒感染的检测不足，限制了我们对其真实疾病负担、空间分布和重要性的了解，从而阻碍了明智的公共卫生决策。

面对这一迫切需求，一个由来自德国、贝宁、秘鲁、巴西等多国研究人员组成的团队开展了一项重要研究，旨在开发一种新型的多重实时逆转录PCR（RT-PCR）检测方法，用于同步、广谱地检测人类致病性甲病毒。该方法不仅适用于监测，也适用于常规诊断，以期以一种成本和时间效益更高的方式，满足全球范围内对共循环甲病毒诊断的紧急需求。该研究成果已发表在《Journal of Clinical Virology》上。

为开展本研究，研究人员运用了几项关键技术方法。首先，他们进行了精密的 assay design（检测方法设计）：从NCBI获取了所有目标甲病毒的基因组序列，利用Geneious Prime软件进行比对分析，针对最小化复合群内遗传差异和最大化复合群间差异的原则，设计并测试了大量引物和探针，最终优化出五个抗原复合群特异性检测（针对EEE、VEE、WEE S、WEE W、SF/MID复合群）和一个CHIKV特异性检测，并将其整合到一个多重反应体系中。其次，他们进行了全面的 analytical validation（分析性能验证）：包括与既往发表的单重实时RT-PCR法和巢式常规RT-PCR法进行灵敏度对比；通过 probit regression（概率回归）计算多种甲病毒的检测限（LOD）；使用高滴度非甲病毒 arboviruses（如DENV、ZIKV等）培养上清液评估特异性；并通过测试高浓度甲病毒RNA评估抗原复合群分配的准确性。第三，他们利用来自贝宁（西非）和秘鲁（南美）的4,308份发热患者血清样本进行了 clinical validation（临床验证），这些样本部分伴有PCR确认的疟疾或登革热急性感染，用以评估新检测方法在真实临床背景下的特异性和实用性。此外，还使用了体外转录RNA（IVTs）来模拟无法获得病毒分离株的目标序列并进行精确定量。

4.1. Assay setup

研究人员成功设计并建立了一个最终的多重检测体系，该体系包含五个甲病毒抗原复合群检测（针对EEE、VEE、WEE S、WEE W、SF/MID复合群）和一个先前已发表的CHIKV特异性实时RT-PCR检测。所有目标及测试的甲病毒均能使用该新多重检测方法成功检出。与两种参考检测方法（一种广谱甲病毒单重实时RT-PCR法和一种巢式常规广谱甲病毒RT-PCR法）并行测试20种覆盖人类致病性甲病毒全部遗传多样性的甲病毒RNA（16种病毒分离株，4种IVTs）后，结果显示，新多重检测法的平均检出率为0.87，显著高于巢式RT-PCR的0.57和单重实时RT-PCR的0.48（Fisher精确检验，p < 0.0001），凸显了其更高的灵敏度和稳健性。

4.2. Analysis of detection limits

为确定多重检测的分析灵敏度，研究人员计算了多种病毒的检测限（LOD）。LOD范围从ONNV的0.83 cps/μl到WEEV的33.05 cps/μl。对于ONNV、GETV、MADV和CABV，其LOD与已发表的病毒特异性检测相当或更低。考虑到核酸提取过程中样本通常会有2-8倍的浓缩，该多重检测的临床检测限对于ONNV低至104-415 cps/mL临床样本，对于WEEV则为4,131-16,525 cps/mL，这与甲病毒感染中典型的较低病毒载量相符，表明其具备诊断敏感性。

4.3. Antigenic complex assignment

为评估抗原复合群的分配准确性，研究人员测试了中等和高浓度RNA样本以模拟潜在的病毒血症水平。EEE和VEE复合群病毒仅在其对应检测中检出。除ONNV外的所有SF复合群病毒在CHIKV检测中均有交叉反应。WEE复合群病毒在VEE复合群检测中存在交叉反应。高浓度样本的交叉检测更为常见。尽管如此，通过比较Ct值和荧光强度，可以成功进行复合群判定，因为特异性检测中的Ct值显著更低、荧光强度显著更高。所有测试的甲病毒均能被正确分配至对应的抗原复合群。

4.4. Clinical validation

为验证新检测的特异性，研究人员测试了一系列发热患者临床样本和高滴度细胞培养上清液。DENV-1至4、黄热病病毒、ZIKV、奥罗普切病毒和裂谷热病毒的细胞培养上清液在多重检测中均为阴性，表明其对甲病毒的特异性。对来自贝宁的1,936份样本（其中53.4%经PCR确认急性疟原虫感染）和来自秘鲁的2,372份样本（其中56.3%经PCR确认急性DENV感染）的测试进一步证实了高特异性：所有贝宁样本甲病毒检测均为阴性，秘鲁样本中除5份外均为阴性（其中3份检出MAYV基因型D，2份检出VEEV亚型ID）。对阳性临床样本的系列稀释测试证实，新多重检测法的灵敏度比参考方法高出几个数量级。在虫媒病原体高度流行的地区，该检测方法展现了强大的稳健性。

本研究成功开发并验证了一种用于检测人类致病性甲病毒并可在血清复合群水平进行判定的新型多重实时RT-PCR检测方法。由于抗原复合群检测并非病毒特异性，而是旨在检测特定的甲病毒进化枝，因此该多重检测法很可能也能检测到尚未知的甲病毒。

大多数虫媒病毒的真实疾病负担因其多样性和诊断局限性而仍然未知。在医疗机构中，30%至50%的未分化发热患者始终无法得到确诊。因此，常规诊断之外的监测对于大流行防范、确保病原体的正确优先级排序以及估计真实的疾病特异性负担至关重要。尽管高通量测序（HTS）在监测，特别是在检测变异和未知病毒方面变得越来越重要，但它需要昂贵的设备，并且在资源有限的环境中往往难以实现。相比之下，基于PCR的监测方法，如我们新型的多重检测，可以广泛实施。先前开发的其他检测方法要么相对更耗时，可能导致假阴性结果，要么使用了并非普遍可用的更复杂的测试化学物质。我们多重检测的短周转时间使得能够快速检测，并且在样本阳性的情况下，可以及时进行抗原复合群分配。相比之下，HTS和PCR扩增后的测序至少需要几天时间才能完成，并且涉及额外的计算分析。快速的周转时间和高灵敏度也可能使得该新多重检测应用于常规诊断。

我们的多重检测法的局限性在于无法检测BFV（在澳大利亚BFV相对更常见，可能需要在当地增加额外的检测），以及除CHIKV外无法判定具体的甲病毒种类。虽然对MAYV和VEEV的PCR产物进行了成功的Sanger测序，但并未经过广泛验证。因此，对于具体的甲病毒判定，可能需要进行额外的检测。

总之，这种新型的多重实时RT-PCR检测方法允许以时间和成本效益高的方式 near-globally（近全球范围）进行甲病毒监测和诊断测试，其灵敏度高于类似检测方法，包括针对全球最重要的甲病毒CHIKV。