细胞外囊泡递送KRAS反义寡核苷酸与RIG-I激动剂协同治疗胰腺癌腹膜转移的安全性与有效性研究

本研究针对胰腺导管腺癌(PDAC)腹膜转移治疗难题，开发了基于红细胞来源细胞外囊泡(EVs)共递送KRAS靶向反义寡核苷酸(ASOs)和免疫调节RNA(immRNA)的创新策略。临床前研究表明该联合疗法通过诱导免疫原性细胞死亡显著抑制肿瘤生长、减少转移灶并延长生存期，且在非人灵长类动物中展现出良好安全性，为PDAC治疗提供了突破性方案。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）是全球最致命的恶性肿瘤之一，五年生存率仅约10%。其致命性源于早期诊断困难、高度免疫抑制的肿瘤微环境，以及高达90%病例中存在的KRAS基因突变。尽管KRAS是理想的治疗靶点，但由于其蛋白结构缺乏传统药物结合位点，直接靶向治疗一直面临巨大挑战。当前化疗方案（如吉西他滨、FOLFIRINOX方案）和免疫疗法对晚期尤其伴有腹膜转移的患者效果有限——约25-50%的PDAC患者会发生腹膜转移，却缺乏有效治疗手段。

为突破这一困境，新加坡国立大学医学院的研究团队开发了一种创新性治疗策略：利用红细胞来源的细胞外囊泡（RBCEVs）共递送KRAS靶向反义寡核苷酸（ASOs）和免疫调节RNA（immRNA，一种RIG-I激动剂）。该研究发表于《Journal of Controlled Release》，系统评估了该联合疗法在临床前模型中的安全性、有效性及免疫调节机制。

研究采用多项关键技术方法：通过钙离子诱导法从人O型血中提取RBCEVs，采用REG-1试剂将化学修饰的ASOs和体外转录的immRNA加载到EVs中；利用患者来源的胰腺癌类器官（PC-PDOs）和免疫健全小鼠腹膜转移模型进行疗效评估；通过非人灵长类动物（食蟹猴）实验完成临床前安全性验证；采用纳米粒子追踪、流式细胞术、qPCR、免疫组化等多维度技术分析生物学效应。

3.1. EVs高效递送核酸至KRAS突变胰腺癌细胞

研究证实RBCEVs能高效将ASOs递送至多种人源和小鼠源PDAC细胞系（包括AsPC-1、CaPAN-1、2838c3热肿瘤和6419c5冷肿瘤细胞）。通过Gapmer策略设计的LNA/2’MOE/PS修饰的ASOs（人KRAS-G12D ASO2、G12V ASO3和小鼠Kras-G12D ASO4）显示出特异性基因敲低效果。联合immRNA的EVs递送在体外表现出剂量依赖性的细胞增殖抑制，并协同激活RIG-I信号通路（上调DDX58、MDA5、IRF7、IFNA/B等基因表达），且对正常人外周血单核细胞无显著毒性。

3.2. 联合疗法激活RIG-I通路诱导PC-PDOs免疫原性死亡

在KRAS突变的人源PC-PDOs模型中，EVs有效递送ASOs至类器官内部（约40%细胞摄取EVs，10%细胞摄取ASOs）。KRAS ASO与immRNA联合处理显著降低肿瘤细胞活力，同步实现KRAS mRNA抑制和RIG-I通路激活，诱导干扰素分泌并引发免疫原性细胞死亡。

3.3. EVs疗法显著抑制小鼠腹膜转移瘤进展

在免疫健全小鼠腹膜转移模型中，DiR标记的EVs注射后1小时即在肿瘤和胰腺中富集，48小时内负载药物的EVs在靶组织积累量高于空载EVs。流式分析显示约20%癌细胞和50%免疫细胞（以巨噬细胞为主）摄取EVs。每两日腹腔注射联合疗法（20 mg/kg）12天后，肿瘤生物发光信号几乎消失，小鼠体重稳定，生存期显著延长。组织学分析显示肿瘤细胞密度降低、免疫细胞浸润增加，TUNEL实验证实凋亡增强。剂量递增实验（10-40 mg/kg）进一步验证疗效的剂量依赖性。

3.4. 联合疗法激活抗肿瘤免疫应答

免疫表型分析显示联合治疗组肿瘤内CD45+免疫细胞、CD4+/CD8+ T细胞和M1型巨噬细胞显著增加，M1/M2比率升高。免疫组化和荧光染色证实CD8+ T细胞和颗粒酶B+细胞浸润增强。脾脏记忆T细胞（TEM亚群）扩增表明系统性免疫激活。qPCR证实肿瘤组织内Kras表达抑制与RIG-I通路激活同步发生。

3.5. 非人灵长类动物安全性验证

食蟹猴腹腔注射5 mg/kg联合制剂后，临床体征、体重、血液参数（CBC、生化指标）、器官组织学及炎症因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ、CRP）均无异常变化，证明该疗法具有良好的安全性特征。

该研究首次证实RBCEVs共递送KRAS ASO与RIG-I激动剂immRNA的协同治疗策略能同时靶向肿瘤发生核心驱动基因和重塑免疫微环境。疗法通过诱导免疫原性细胞死亡和激活固有/适应性免疫应答，显著抑制PDAC原发灶和腹膜转移灶进展。RBCEVs因其低免疫原性、高生物相容性和靶向性成为理想递送载体，而腹腔给药方式契合腹膜转移的临床治疗需求。非人灵长类动物安全数据为临床转化提供坚实依据。这一多机制协同策略为突破PDAC治疗瓶颈提供了新范式，尤其对免疫冷肿瘤和耐药性腹膜转移患者具有重要应用前景。