美洲龙虾抗革兰氏阳性菌感染的免疫基因表达谱解析：RNA测序揭示肝胰腺关键免疫通路与靶点

本研究针对美洲龙虾（Homarus americanus）易受革兰氏阳性菌Aerococcus viridans var. homari感染的问题，采用RNA-seq技术系统分析了感染过程中肝胰腺29,000余个基因的表达变化。研究发现1,803个差异表达基因，其中87个为免疫相关基因，包括ALFs、SAA、Toll-like受体、细胞因子及抗氧化基因等，揭示了龙虾针对特定病原的免疫调控机制，为甲壳类免疫学研究提供了重要数据支撑。

　　

在加拿大辽阔的大西洋沿岸，美洲龙虾（Homarus americanus）不仅构成了生态链的重要一环，更是支撑当地经济的支柱产业。2024年，加拿大龙虾捕捞产值超过29.4亿加元，占全国海产品出口总值的36.3%。然而，这种具有极高经济价值的物种却面临着一种致命威胁——由革兰氏阳性菌Aerococcus viridans var. homari引起的龙虾败血病（Gaffkemia）。这种细菌能够通过龙虾外壳的伤口侵入体内，造成系统性感染，历史上曾导致北美和欧洲龙虾种群周期性大量死亡。

尽管龙虾养殖业面临如此严峻的挑战，科学界对龙虾与病原体相互作用的分子机制了解仍然有限。特别是针对A. viridans var. homari这种特定病原体，龙虾如何调动其免疫系统进行防御，哪些关键基因参与这一过程，这些问题都亟待解答。传统的基因表达研究技术如微阵列存在局限性，只能检测已知基因的表达情况，而可能遗漏许多未知的重要免疫基因。

为了解决这一知识空白，由Zohreh Fazelan、Nicolas Argenta、Spencer J. Greenwood和K.Fraser Clark组成的研究团队开展了一项深入研究。他们采用先进的RNA测序（RNA-seq）技术，全面分析了美洲龙虾在A. viridans var. homari感染过程中肝胰腺组织的基因表达变化。这项研究最近发表在《Journal of Invertebrate Pathology》上，为理解甲壳类动物的免疫机制提供了宝贵见解。

研究人员采用了多项关键技术方法开展本研究。他们从加拿大新斯科舍省的海产品供应商处获得38只成年雄性美洲龙虾，经过健康筛查后，36只无感染的龙虾被用于实验。研究使用A. viridans var. homari的Rabin菌株进行感染挑战，通过在龙虾体内注射含7.5×10⁷ CFU/mL的菌液来模拟自然感染过程。在感染后6小时、24小时和78小时分别采集肝胰腺组织样本，同时设立盐水注射的对照组。RNA提取后使用Illumina Novaseq PE100技术进行测序，利用欧洲UseGalaxy服务器进行分析，包括质量评估、序列比对到龙虾参考基因组（GCF_018991925.1），以及使用DESeq2和edgeR进行差异表达基因分析。

3.1. Aerococcus viridans var. Homari感染确认和血细胞反应

研究人员通过组织学和血淋巴培养确认了A. viridans var. homari感染的成功建立。感染龙虾在76小时后出现系统性感染。总血细胞计数（THC）显示，感染动物在48小时后的循环血细胞数量显著减少，表明免疫系统正在积极应对感染。

3.2. 转录组测序和读取质量指标

经过修剪和过滤，获得了422,242,177条高质量读取（Phred分数>30），平均每个样本有23,457,899条PE100读取。StringTie合并生成了包含29,415个基因的转录组。

3.3. 差异表达分析

使用DESeq2和edgeR两种方法（FDR < 0.05）进行差异表达基因（DEGs）分析。DESeq2识别出1,803个非冗余DEGs，而edgeR识别出856个DEGs。研究发现，随着感染时间的推移，差异表达基因的数量逐渐增加，在78小时达到高峰。

热图分析显示，感染78小时的样本形成了独特的聚类，表明该时间点具有独特的基因表达特征。感染24小时的样本聚集在一起，但与感染6小时的样本更为相似。对照组样本在78小时和6小时表现出相似的基因表达模式。

特别值得注意的是87个被注释为免疫或免疫相关基因的DEGs。这些基因的表达模式与感染进程密切相关，表明它们在病原体挑战过程中发挥着重要作用。

研究发现10个H. americanus抗脂多糖因子（ALFs）基因中有5个在感染过程中差异表达，主要在78小时显著上调。其中HA-ALF-L4表达量增加39.2倍，其次是HA-ALF-L1、HA-ALF-L2、HA-ALF-L6-like-a和HA-ALF-L1-like，均在78小时上调超过8倍。

两个血清淀粉样蛋白A-5样蛋白（SAA-5-like-a和SAA-5-like-b）基因和一个高血糖激素基因在感染动物78小时显著上调，变化倍数分别为37.6、3.2和9.5倍。

Toll样受体（TLR）信号通路中的多个基因出现差异表达。cactus-a剪接变体基因和relish/核因子NF-kappa-B p100亚基样异构体X2-a（relish/NF-κB-a）基因在78小时分别显著上调2.6和1.7倍。两个肽聚糖识别蛋白（a和b）基因在感染动物中表达显著增加，分别在78小时增加3.5倍和在24小时增加2.4倍。

13个凝集素编码基因在感染过程中显示显著差异表达。techylectin-5A-like基因上调最显著，在78小时变化11倍。perlucin样蛋白异构体X1基因和一个推定的凝集素C型结构域包含蛋白6基因均增加约7倍。

参与信号级联的DEGs表达分析显示，肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样（TNFAIP8）、干扰素调节因子4样部分（IRF-4-like）和细胞因子诱导的SH2包含蛋白样（CISH-like）基因在78小时显著增加1.8到19.6倍。

氧化还原相关基因表达变化在78小时最为显著，硫氧还蛋白-2样（Trx2-like）、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]样（SOD-like）和谷胱甘肽过氧化物酶2样（GPx2-like）基因表达显著增加5.6、5.9和6.1倍，而过氧化氢酶样（CAT-like）基因表达显著降低3.7倍。

酚氧化酶激活因子的显著上调范围在78小时为3.2到5.5倍。参与凝血途径的几个基因也出现差异表达。谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶（转谷氨酰胺酶）样基因在78小时显著增加4.9倍。凝血因子B样异构体X2、凝血因子IX样和黑化蛋白酶1样基因显著上调，在78小时变化范围从11.6到12.4倍。

研究结论和讨论部分强调了这些发现的重要意义。研究表明，美洲龙虾在应对A. viridans var. homari感染时，其肝胰腺组织表现出复杂而协调的免疫基因表达变化。ALFs和SAA-5样蛋白的上调表明它们在龙虾免疫防御中起着关键作用。不同ALFs的表达模式差异可能反映了龙虾对特定病原体的定制化免疫应答。

Toll样受体信号通路基因的差异表达揭示了龙虾识别和响应细菌感染的分子机制。MyD88样和relish/NF-κB-a的上调表明免疫应答的激活，而FliI样的上调可能代表了一种负反馈调节机制，防止过度免疫反应。

抗氧化防御系统的基因表达变化表明，龙虾在感染过程中面临着氧化应激挑战，并通过调整抗氧化酶的表达来应对这一挑战。凝血和黑化相关基因的上调表明这些 humoural 免疫反应在限制病原体传播和促进病原体清除中发挥着重要作用。

与先前使用微阵列技术的研究相比，RNA-seq方法发现了更广泛的免疫基因，包括许多以前未在H. americanus中检测到的基因。这突出了RNA-seq技术在全面解析免疫应答方面的优势。

这项研究不仅增进了我们对龙虾免疫系统的理解，也为开发新的龙虾健康管理策略提供了分子基础。确定的关键免疫基因如ALFs和SAA可能作为龙虾健康状态的生物标志物，用于监测养殖龙虾的健康状况和早期疾病诊断。

总的来说，这项研究通过先进的转录组学技术揭示了美洲龙虾应对细菌感染的复杂免疫调控网络，为甲壳类动物免疫学提供了重要见解，并对龙虾养殖业的可持续发展具有重要实践意义。