多色免疫荧光结合原位mRNA空间分析揭示急性淋巴细胞白血病纤维化驱动因子TGFB1与PDGFA1的表达机制

本研究针对急性淋巴细胞白血病（ALL）骨髓纤维化机制不明的临床问题，通过创新性结合多色免疫荧光染色与RNAscope?原位mRNA表达分析技术，首次发现ALL巨核细胞和白血病母细胞中TGFB1和PDGFA1表达显著上调，且与纤维化程度正相关，为开发抗纤维化治疗策略提供了重要靶点依据。

　　

急性淋巴细胞白血病（ALL）作为最常见的儿童恶性肿瘤，虽然现代治疗手段已显著提高患儿生存率，但仍有部分患者面临治疗反应不佳的困境。近年来研究发现，骨髓纤维化作为造血微环境（HME）最严重的病理改变之一，与ALL的不良预后密切相关——高网状纤维密度不仅与治疗后微小残留病（MRD）水平升高相关，甚至会影响CAR-T细胞治疗的疗效。然而与传统认知中由巨核细胞异常驱动的原发性骨髓纤维化（PMF）不同，ALL患者的骨髓呈现完全相反的细胞组成：白血病母细胞高度增殖而巨核细胞数量显著减少。这种病理差异使得ALL纤维化的驱动机制成为未解之谜。

为破解这一难题，瑞典隆德大学分子血液学与干细胞中心的研究团队在《Laboratory Investigation》上发表了一项突破性研究。他们开创性地将多色免疫荧光（IF）染色与RNAscope?原位mRNA分析技术相结合，首次在空间单细胞层面揭示了TGFB1（转化生长因子β1）和PDGFA1（血小板衍生生长因子α1）在ALL纤维化过程中的关键作用。

研究人员采用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的临床骨髓活检样本，包括9例儿童Ph阴性B-ALL（纤维化分级0-2级）、3例PMF和3例正常对照。通过五色免疫荧光面板（CD45、CD271、CD31、CD34和DAPI）识别不同骨髓细胞类型，并结合RNAscope?探针实现TGFB1和PDGFA1 mRNA的空间定位分析。利用Olympus VS120扫描仪和Leica Stellaris 5共聚焦显微镜进行高分辨率成像，通过Arivis Vision 4D和QuPath软件进行图像处理与定量分析。同时重新分析了已发表的单细胞RNA测序数据集（GEO: GSE134759）验证发现。

多色IF染色揭示ALL骨髓架构特征

研究团队建立的序贯多色IF染色技术成功解析了ALL、PMF和正常骨髓的细胞组成差异。PMF样本呈现典型的巨核细胞（MK）簇状增生和异常形态，而ALL样本则以高细胞密度和大量CD45⁺白血病母细胞为特征。值得注意的是，CD271⁺间充质基质细胞（MSC）在纤维化ALL和PMF中均显著增加，且呈现沿血管密集分布的独特模式，与纤维化区域分布高度重合。

CD271表达与ALL纤维化程度正相关

通过体积定量分析发现，CD271⁺ MSC的标准化体积在纤维化分级2级的ALL样本中显著增加，与PMF样本相当。这种空间分布特征表明MSC可能通过分化为肌成纤维细胞参与纤维化进程，而位于血管周围的分布模式提示其与血管微环境的相互作用可能在纤维化中发挥重要作用。

原位双标技术发现细胞因子表达异常

结合RNAscope?与IF的双重标记技术揭示了令人惊讶的发现：与预期相反，ALL样本的TGFB1和PDGFA1表达水平显著高于PMF和正常对照。特别是ALL巨核细胞表现出强烈的细胞因子表达信号，且表达强度与纤维化程度呈正相关。白血病母细胞同样表达这两种因子，尽管强度低于巨核细胞。这一发现颠覆了传统认知——在ALL中，非恶性的巨核细胞和恶性母细胞竟成为纤维化驱动因子的主要来源。

单细胞测序数据验证表达模式

对已发表scRNA-seq数据的重新分析证实，在诊断期和复发期ALL样本中确实存在TGFB1/PDGFA1双阳性母细胞群体，而缓解期样本中该群体消失，健康对照中几乎不表达。这一独立方法的验证进一步支持了空间转录组发现的可靠性。

空间表达定量确认MK区域特异性

通过计算巨核细胞区域与非巨核细胞区域的表达比值，研究发现纤维化分级2级的ALL样本中PDGFA1和TGFB1在MK区域的表达比值显著升高。单细胞强度定量分析显示，ALL-MK中的细胞因子表达水平最高，CD271⁺细胞在纤维化ALL中也呈现高表达特征。

这项研究首次在空间单细胞层面证实了ALL骨髓纤维化的独特驱动机制：尽管ALL与PMF在细胞组成上截然不同，却共享相似的纤维化驱动因子表达模式。TGFB1和PDGFA1在ALL巨核细胞和白血病母细胞中的异常高表达，为解释ALL纤维化现象提供了全新的分子机制视角。

该研究的发现具有重要的临床意义：首先，明确了TGFB1和PDGFA1作为ALL纤维化的潜在治疗靶点；其次，开发的多模式空间分析技术为肿瘤微环境研究提供了新范式；最后，研究结果提示针对纤维化微环境的治疗策略可能改善ALL患者的治疗反应和预后。未来研究可进一步拓展细胞因子panel，开展纵向治疗反应关联分析，并通过新型异种移植模型进行功能验证，最终为开发针对ALL骨髓纤维化的靶向治疗奠定基础。