循环细胞外囊泡circ_PPAPDC1A作为NSCLC免疫检查点抑制剂耐药的新型诊断与预后生物标志物研究

本刊推荐：免疫检查点抑制剂（ICIs）耐药是非小细胞肺癌（NSCLC）临床治疗的重大挑战。本研究通过体内外实验证实，肿瘤源性循环细胞外囊泡（EVs）携带的circ_PPAPDC1A通过诱导CD8+ T细胞耗竭促进ICIs耐药，多中心队列研究显示其诊断效能优异（AUC=0.98）且与较短无进展生存期（PFS）显著相关，为NSCLC免疫耐药提供了新型液体活检标志物。

　　

免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）的出现为晚期非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）患者带来了革命性的治疗突破，将五年生存率从不足5%显著提升至31.9%。然而与其它抗肿瘤药物相似，绝大多数初始响应ICIs治疗的NSCLC患者最终都会出现疾病进展或复发，发展为ICIs耐药。目前临床实践中缺乏高敏感性的耐药生物标志物，主要依赖影像学检查，但这种方法不仅滞后于耐药的实际发生，还存在假性进展的干扰，导致其评估价值有限。

近年来，肿瘤源性循环细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）因其携带丰富的生物大分子（包括核酸、蛋白质、脂质等），并具有高稳定性、强特异性和非侵入性检测等优势，成为癌症诊断和治疗领域最具前景的生物标志物。其中环状RNA（circular RNA, circRNA）作为EVs的主要携带成分，在肿瘤发生发展及耐药过程中起关键调控作用。本研究团队前期发现circ_PPAPDC1A在奥希替尼（Osimertinib）耐药NSCLC患者中高表达，且临床实践提示其表达水平与ICIs疗效呈负相关，由此提出科学假设：circ_PPAPDC1A可能与ICIs耐药相关。

为验证这一假设，研究人员在《npj Precision Oncology》发表了题为"Diagnostic and prognostic roles of circulating EVs circ_PPAPDC1A in ICIs resistance in NSCLC"的原创性研究。该研究通过构建circ_PPAPDC1A过表达和敲降的细胞模型，建立NSCLC细胞与T细胞的共培养体系，结合小鼠异种移植实验和多中心临床队列分析（纳入40例接受ICIs治疗的NSCLC患者），系统探究了circ_PPAPDC1A在ICIs耐药中的功能机制及临床价值。

关键技术方法包括：1）利用慢病毒载体构建circ_PPAPDC1A过表达和敲降细胞系；2）建立NSCLC细胞与CD8⁺ T细胞的体外共培养模型；3）采用CCK-8、软琼脂克隆形成、Transwell侵袭、划痕愈合、Annexin V-FITC/PI染色等多种功能实验评估细胞表型；4）通过小鼠异种移植模型进行体内抗PD-1治疗实验；5）使用免疫组化、流式细胞术和ELISA分析肿瘤免疫微环境；6）从多中心队列患者血清中分离EVs，通过电镜、Western blot和RT-qPCR进行鉴定与表达分析。

研究结果方面：

Higher circ_PPAPDC1A expression is associated with a poorer response to ICIs

通过对5对奥希替尼耐药NSCLC患者的组织样本进行circRNA微阵列分析，发现circ_PPAPDC1A在耐药患者中显著高表达。临床响应评估显示，circ_PPAPDC1A高表达患者（case#2和case#4）在接受两个周期ICIs治疗后出现疾病进展（PD）并产生耐药，而低表达患者（case#1、case#3和case#5）则呈现疾病改善（PR或SD）。

circ_PPAPDC1A promotes cell proliferation and clonogenesis in vitro

在T细胞共培养体系中，circ_PPAPDC1A过表达显著增强NSCLC细胞对帕博利珠单抗（Pembrolizumab）的耐药性，促进细胞活力和克隆形成能力；而敲降circ_PPAPDC1A则显著抑制这些效应。

circ_PPAPDC1A promotes cell invasion and migration in vitro

Matrigel侵袭和划痕愈合实验表明，circ_PPAPDC1A过表达显著增强细胞侵袭和迁移能力，敲降则抑制这些表型，证实其能降低NSCLC细胞对ICIs的敏感性。

circ_PPAPDC1A inhibits cell apoptosis in vitro

细胞凋亡检测显示，circ_PPAPDC1A过表达抑制Pembrolizumab诱导的细胞凋亡并降低Caspase-3活性，而敲降则促进凋亡，表明其通过抗凋亡作用介导耐药。

circ_PPAPDC1A promotes NSCLC progression in vivo

小鼠异种移植实验证实，circ_PPAPDC1A过表达促进肿瘤生长、增加肿瘤重量和体积，并上调Ki-67阳性细胞比例、抑制细胞凋亡；敲降则产生相反效应，表明其在体内促进NSCLC进展。

circ_PPAPDC1A induces CD8⁺ T-cell exhaustion in vivo

免疫组化和流式分析显示，circ_PPAPDC1A过表达导致CD8⁺ T细胞和IFN-γ⁺细胞比例降低，免疫增强因子（CXCL9、CXCL10、IFN-γ、IL-2）减少，免疫抑制因子（TGF-β、IL-1β）激活，证实其通过诱导CD8⁺ T细胞耗竭促进免疫抑制微环境。

circ_PPAPDC1A existed in circulating extracellular vesicles and derives from NSCLC cells

RNase处理实验证实circ_PPAPDC1A主要通过EVs形式分泌到细胞培养上清液中，且其表达受EVs膜保护，提示肿瘤细胞通过EVs分泌circ_PPAPDC1A进行细胞间通讯。

Circulating extracellular vesicles circ_PPAPDC1A serve as biomarker for ICIs resistance diagnosis and prognostic analysis

对40例NSCLC患者的队列研究显示，ICIs耐药患者循环EVs circ_PPAPDC1A表达显著上调，诊断效能优异（AUC=0.98），且高表达患者无进展生存期（PFS）显著缩短（6.15个月 vs 9.25个月）。

研究结论与讨论部分强调，circ_PPAPDC1A通过促进细胞增殖、侵袭、迁移和抗凋亡，诱导CD8⁺ T细胞耗竭和免疫抑制微环境，从而降低NSCLC细胞对ICIs的敏感性。循环EVs circ_PPAPDC1A作为一种稳定、非侵入性的生物标志物，对ICIs耐药的早期诊断和预后评估具有重要临床价值。该研究不仅揭示了ICIs耐药的新机制，为克服耐药提供了潜在治疗靶点，还开创了基于EVs circRNA的液体活检新策略，对推动NSCLC精准免疫治疗具有重要意义。