公共数据库中IncP-1质粒RK2复制起始蛋白TrfA相关序列的系统分析与进化研究揭示复制子分型的局限性

本研究针对利用复制起始蛋白TrfA进行IncP-1质粒分型存在可靠性不明的问题，通过系统分析NCBI非冗余数据库中TrfA同源序列的分布与进化特征，发现TrfA广泛存在于不同分类群和复制子类型中，揭示单基因复制子分型可能高估IncP-1质粒存在风险，为质粒群体识别提供了重要方法论参考。

　　

在微生物世界中，质粒作为染色体外的遗传元件，能够赋予宿主菌抗生素抗性、毒力因子和代谢功能等特性，尤其是广宿主范围的IncP-1质粒，可在不同细菌类群间水平转移基因，对环境中耐药基因的传播起到关键作用。IncP-1质群的典型代表RK2（又称RP4）含有一个关键的复制起始蛋白基因trfA，该基因编码两种不同长度的蛋白变体TrfA1（TrfA-44）和TrfA2（TrfA-33），分别调控质粒在不同宿主中的复制效率。长期以来，研究者利用trfA基因序列进行复制子分型（replicon typing），在基因组和宏基因组数据中检测IncP-1质粒。然而，公共数据库中这些同源序列的真实分布和特性从未被系统评估，导致人们难以判断：检测到trfA同源序列是否就一定意味着存在完整的IncP-1型质粒？

为此，Suzuki等人开展了一项系统性的生物信息学研究，旨在揭示NCBI非冗余数据库中与IncP-1质粒RK2的TrfA蛋白相似的序列究竟分布何处、具有怎样的特性，进而评估基于TrfA的复制子分型方法在识别IncP-1质粒中的可靠性。该研究近期发表于《Plasmid》杂志。

为全面探索TrfA同源序列的分布与特性，研究团队采用了多种生物信息学方法：首先利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）对NCBI非冗余核酸（nr-nt）和氨基酸（nr-aa）数据库进行同源搜索，获取与TrfA高度相似的序列；通过blastdbcmd和taxonkit工具提取序列并注释分类信息；进一步利用LS-BSR（large-scale blast score ratio）流程分析候选质粒与RK2的基因内容相似性；最后选取代表性TrfA相关蛋白序列，基于多序列比对和邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，揭示其进化关系。

3.1. TrfA匹配的核苷酸序列在NCBI nr-nt数据库中的分布特征

通过tblastn搜索，共获得1,675条TrfA匹配的核苷酸序列。长度分析显示，这些序列长度差异极大（171 bp–7.9 Mbp），其中884条标注为“质粒”，171条属于“染色体”，其余则分布于克隆载体、环境样本和病毒序列中。更重要的是，这些序列在分类上覆盖了细菌（主要为Pseudomonadota）、真核生物甚至病毒序列。例如，某些序列来自淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）或真核生物（如大豆克隆序列），但它们很可能是实验构建载体（如农杆菌双元载体）的残留。这一发现表明，trfA基因并非IncP-1质粒所独有，它可能通过水平转移进入其他复制子，甚至染色体区域。

3.1.2. 候选IncP-1质粒的筛选与基因内容相似性评估

从上述序列中，研究人员筛选出757条trfA携带质粒（排除了部分基因序列和染色体来源数据）。为评估它们与IncP-1质粒RK2的遗传相似性，研究团队以RK2的76个蛋白质为参考，通过LS-BSR分析计算每个质粒的BSR值。结果显示，这些质粒中与RK2同源的基因数量为2–76个（中位数42），平均BSR值介于0.067–0.98（中位数0.33）。根据既往标准（同源基因数超过半数即38个），共有387个质粒被认定为候选IncP-1质粒，其中包括此前未明确归类为IncP-1的质粒（如来源于Eikenella exigua和部分淋病奈瑟菌的质粒）。值得注意的是，所有757个质粒均与TrfA2匹配，但IncP-1δ亚群质粒（如pAKD4、pEST4011和pIJB1）缺乏TrfA1特有的N端区域，这与文献中它们仅编码TrfA2的结论一致。

3.2. TrfA相关蛋白序列的系统发育分析

从nr-aa数据库中，研究人员共提取4,633条TrfA匹配蛋白序列，长度分布广泛（23–687 aa）， annotations多样，包括“假设蛋白”、“复制起始蛋白”和“转座酶”等。选取21条代表性序列（来源于质粒、染色体和病毒）进行系统发育分析。邻接树显示，IncP-1质粒（包括α、β、γ、δ、ε、ζ亚型）的TrfA蛋白形成一个高支持度的单系群（100% bootstrap），表明它们垂直起源于共同祖先。然而，其他一些序列（如来源于Eikenella exigua质粒、Thiomonas质粒及某些Gammaproteobacteria染色体的TrfA同源蛋白）虽与IncP-1质粒群相近，却未形成严格意义上的IncP-1分支。例如，此前被归为IncP-1β的质粒pTHI在本研究中并未与IncP-1核心群聚在一起，说明单纯依靠序列相似性可能误导分型结果。

4. 结论与展望

本研究通过大规模数据库挖掘和系统发育分析，揭示出TrfA同源序列广泛存在于不同复制子（染色体、质粒、病毒）和分类群中，它们不仅来源于IncP-1质粒，还可能通过水平基因转移进入其他遗传背景。因此，仅凭trfA序列相似性就断定IncP-1质粒的存在是不充分的，复制子分型方法在复杂环境样本（如宏基因组）中的应用需格外谨慎。

未来，该分析框架可扩展至其他Inc群（如IncP-2–IncP-14）以及肠杆菌科的质粒分型。准确识别介导抗生素耐药性传播的关键质粒群体，对于制定针对性的阻控策略具有重要意义。尽管复制子分型在初步筛查中具有高效、快速的优点，但若要精确鉴定质粒身份，仍需结合系统发育分析、平均核苷酸一致性（ANI）或松弛酶分型（MOB typing）等多重方法。