接合性质粒建立过程中合子基因表达策略：抗防御机制与调控网络解析

本研究聚焦接合性质粒为克服宿主防御系统（如R-M、CRISPR-Cas和SOS响应）而在先导区编码的合子表达程序。研究人员系统阐述了单链DNA启动子（ssDNA promoters）和双链DNA启动子（dsDNA promoters）的时序调控机制，以及蛋白质转运在质粒成功建立中的关键作用，揭示了质粒与宿主在进化军备竞赛中的新颖对策，对理解水平基因转移和抗菌素耐药性传播具有重要意义。

　　

在细菌世界中，接合性质粒作为可自我转移的DNA分子，是水平基因转移的关键驱动者，也是抗菌素耐药性传播的重要载体。它们常常携带编码毒力、细菌间竞争和耐药性的基因，为宿主菌在特定环境条件下提供显著优势。然而，获得和维持这些质粒会给宿主细胞带来代谢负担，这种固有的适应性成本驱动了一场持续的进化军备竞赛：细菌不断进化出防御机制来限制或消除质粒入侵，而质粒则相应地演化出复杂的对抗策略以确保其存活和传播。

质粒成功在新宿主中建立需要克服多种细菌防御机制，包括限制修饰系统（R-M systems）、CRISPR-Cas系统和SOS响应。这些宿主防御针对质粒生命周期的不同阶段，可分为针对初始质粒建立的屏障和破坏长期质粒维持的系统。建立屏障通常在质粒进入时作为即时、瞬时的障碍发挥作用，而其他系统，包括最近发现的抗质粒机制，则主动针对长期维持并增加质粒携带的适应性成本。质粒通过其先导区（leading region）编码的合子程序（zygotic program）来实现这一目标，该程序在接合早期表达抗防御基因。这个程序采用了多种策略，包括单链启动子（ssDNA promoters）、被抑制的双链启动子（repressed double-stranded promoters）和蛋白质转运（protein translocation）。

为了深入解析这些机制，研究人员在《Plasmid》上发表了系统性的综述。他们的研究主要基于对已有文献的荟萃分析和对基因组、宏基因组数据集的计算生物学分析，重点考察了IncI1（如ColIb-P9, R64）、IncF（如F, R1, pED208）、IncP-1α（RP4）、IncW（R388）和IncN（pKM101）等典型质粒模型。关键技术方法包括：使用Cre重组酶易位测定（CRAfT）来鉴定通过接合 machinery 转运的蛋白质；通过体外转录测定和体内接合实验验证ssDNA启动子（如Frpo）的活性；利用数学建模分析由负调控dsDNA启动子控制的基因网络的瞬态表达动力学；以及对大量质粒序列进行生物信息学分析，以统计先导区内抗防御基因家族的分布和保守性。

1. ssDNA promoter regulating leading operons

IncI1和IncF质粒的先导区具有高度相似的组织结构和保守的基因内容。更重要的是，它们的先导基因是在传入的质粒转化为其dsDNA形式之前，从单链启动子转录的。Masai & Arai在F质粒上的早期研究鉴定了一个单链非编码序列，它可以折叠成发夹结构，其中双链化的碱基会重建转录起始所需的-35和-10框。这个Frpo（F RNA polymerase）茎环结构可以招募sigma70负载的RNA聚合酶全酶并在体外启动RNA合成，这个过程被宿主编码的单链DNA结合蛋白（SSB）强烈促进。Frpo的双链形式与其ssDNA形式相比，体外转录活性显著降低，表明Frpo仅作为单链启动子发挥作用。这些发现得到了体内数据的证实，表明由Frpo调控的先导区蛋白仅在接合早期阶段在受体细胞中产生，在传入的质粒DNA转化为dsDNA之前。先导区通常包含多个Frpo和Frpo样序列。在ColIB-P9质粒上鉴定的三个ssi（single-stranded initiation）序列也显示出类似共识的-35框，前面是AT-rich的上游元件（UP elements），而它们的-10框是简并的，在两个双链链之间表现出错配。通过定点诱变纠正这些错配会 drastically 降低ssDNA启动子活性，显示了它们对启动RNA合成的重要性。这些错配形成的间隙类似于转录气泡，当RNA聚合酶结合启动子以创建转录起始所需的开放复合物时形成。这些ssDNA启动子中的错配可能有助于开放复合物的形成并使RNA聚合酶能够启动子逃逸，从而促进有效的转录起始。

2. dsDNA-based zygotic gene expression networks

广宿主范围质粒RP4（IncP-1α）编码几个当被克隆时是有毒的决定子（kil genes），除非相应的质粒编码的阻遏物（Kor repressors）在反式中产生。kil基因包括五个操纵子（kilA, B, C, D and E），每个都从一个被一个或多个Kor阻遏物（KorA, B, C）负调控的启动子转录。这些kor阻遏物基因和kilA, kilC, kilD and kilE操纵子都编码在RP4的先导区，表明它们在传入质粒后不久在受体细胞中的合子表达，类似于IncF和IncI1质粒的先导基因。确实，在合子接合子中kil和kor基因的表达水平比质粒已建立的细胞中高几个数量级。因此，kil操纵子似乎是合子程序的一部分，该程序源于负调控启动子在Kor阻遏物水平达到足以抑制这些启动子的阈值之前的瞬时无抑制活性。类似的kil样操纵子在IncW质粒R388的先导区也被发现。这些四个操纵子被两个阻遏物ArdK和StbA负调控，并已被证明在接合早期阶段与其他负调控操纵子一起被瞬时转录。这个调控网络的数学建模表明，这种瞬时表达源于转录爆发，类似于为RP4 kil-kor系统所提出的。在IncN质粒pKM101的先导区也鉴定了称为CUPs（Conserved Upstream）的重复遗传元件。这些元件包含一个强启动子，可以被两个质粒编码的阻遏物ArdK和ArdR负调控。这两个阻遏物控制pKM101先导区中几个CUP-controlled genes (ccg)的操纵子，表明这个调控网络的功能类似于RP4 kil-kor系统来驱动合子表达程序。

3. Translocation of leading proteins during conjugation

除了合子表达，质粒蛋白水平在接合子细胞中的快速增加也可以通过蛋白质通过接合 machinery 从供体细胞直接易位到受体细胞来实现。质粒DNA本身与一个松弛酶蛋白相连被易位，后者携带一个易位 motif用于将松弛体复合物寻址到T4SS耦合蛋白。通过接合T4SS易位的其他蛋白质例子包括Fic毒素、分配蛋白和根瘤菌毒力因子。最近的系统研究采用Cre重组酶易位测定（CRAfT）来鉴定易位的蛋白质。这种方法使用Cre融合的易位候选物 coupled to loxP重组在受体细胞中作为遗传陷阱。使用这种方法，该研究证实了16种先导区和维持相关蛋白以及IncF质粒pED208的TraI松弛酶的易位，进一步强调了蛋白质易位在质粒生物学中的更广泛作用。早期在IncP-1和IncI1质粒中的研究也表明，质粒编码的DNA引物酶（对于互补链合成至关重要）可以从供体细胞易位到受体细胞。然而，虽然F质粒的先导区蛋白生产可以通过荧光显微镜在接合子中检测到，但在供体细胞中低于检测水平。这表明基因表达在接合子中是先导区蛋白的主要来源，或者需要特定信号（例如，细胞间接触）来引发供体细胞中的先导蛋白合成，类似于R388菌毛生物合成被受体细胞的存在激活。因为这两种机制，易位和de novo表达，并不相互排斥，有人提出它们在该过程的不同步骤中扮演不同的角色。蛋白质易位可能在交配对形成后立即发生，使得少量先导区蛋白能够在de novo蛋白合成启动以实现更高蛋白浓度之前，在受体细胞中发挥其活性。

4. Functions of the plasmid leading region genes

早期研究强调了质粒先导区内基因对于接合过程中成功建立的潜在重要性。这些质粒编码多种基因，其中许多仍然特征不清。然而，一些已被证明在克服受体细胞防御中起关键作用。一个关键角色是PsiB，它抑制同源重组蛋白RecA的活性，包括SOS调节子去抑制所需的LexA切割。这些先导区中另一个保守基因是psiA，也注释为SOS抑制剂，通常位于psiB附近。虽然研究表明PsiB是主要的SOS响应抑制剂，而PsiA似乎对抑制没有影响，但PsiA的作用仍有待充分阐明。先导区还经常编码与染色体同源物高度相似的单链DNA结合蛋白（SSBs）。这些质粒编码的SSB可能稳定传入的ssDNA，保护其免于降解，并与PsiB协同抑制SOS响应。此外，SSB连同Bet/Exo重组 machinery 可以通过促进dsDNA断裂修复来促进IncA/C质粒的CRISPR–Cas evasion。最后，与DNA分配蛋白ParB具有结构域同一性的ParB样同源物在先导区中也高度丰富。然而，目前缺乏这些先导区携带的ParB样蛋白具有分配活性的直接证据。

除了这些参与DNA维持和保护的蛋白质，先导区编码抵消其他宿主防御的因子。限制修饰（R-M）系统是细菌宿主对抗外来DNA最普遍的机制。因此，质粒先导区中注释的大多数基因预计会抵消R-M系统。质粒进化出两种主要策略来克服基于R-M的防御：（1）通过质粒编码的抗限制蛋白直接抑制宿主限制性内切酶；（2）通过质粒编码的甲基转移酶对质粒DNA进行“自身”甲基化，有效地将DNA从限制酶中隐藏起来。ArdA是在质粒先导区背景下第一个被表征的抗限制蛋白之一。这种蛋白通过模仿DNA限制位点的结构来发挥作用。重要的是，ArdA特异性抑制限制活性而不影响甲基化，允许质粒被甲基化从而被识别为“自身”DNA。其他抗限制蛋白家族也在质粒先导区中发现。这些包括由pKM101（IncN）或R64（IncI1）等质粒编码的ArdB；其同源物KlcA，发现在IncP-1α质粒RP4上；以及由IncW质粒R388编码的ArdC。

甲基转移酶，经常在质粒先导区内编码，提供对抗宿主R-M系统的额外保护层。一个这样的例子是M.EcoGIX，在IncI1质粒pESBL的先导区鉴定的一种甲基转移酶。这种甲基转移酶混杂地在ssDNA上的腺嘌呤（adenines）进行甲基化，从而在接合早期阶段保护其免受限制。M.EcoGIX的同源物广泛分布于IncI1和IncF质粒中。

CRISPR-Cas系统是第二广泛的细菌防御系统，靶向噬菌体和质粒。移动遗传元件逃避CRISPR-Cas免疫的一种方式是编码抗CRISPR（Acr）蛋白。这些蛋白通常很小且高度多样，缺乏保守序列特征或与已知功能蛋白质的同源性，这使得它们的检测具有挑战性。然而，几个注释的Acr蛋白家族经常在质粒先导区编码。例如，AcrIE9，I-E型CRISPR-Cas系统的抑制剂，是质粒先导区中最丰富的100个蛋白质家族之一。

毒素-抗毒素（TA）系统是另一类经常在质粒先导区编码的基因。这些小的遗传模块，包含一个毒素及其同源抗毒素，在质粒上普遍存在，并通过质粒游离后代细胞的分离后杀戮（PSK）促进质粒维持。已经提出了几种关于先导区内TA系统对质粒建立贡献的假设：（1）如果传入的质粒未能建立，则诱导细胞死亡，间接保护其免受宿主防御；（2）作为对抗其他移动遗传元素的防御系统，包括可能干扰接合的竞争质粒和噬菌体；（3）可能中和由质粒进入激活的受体编码的毒素。此外，先导区编码的TA系统可以保护这些区域的完整性，这些区域通常包含易受同源重组和切除的重复序列（例如，Frpo, CUP）。通过反选择此类重复之间的重组，TA系统保护先导区及其相关 cargo。例如，由几种IncF质粒编码的hok-sok系统可以反选择Frpo1和Frpo2之间的重组，从而维持中间序列的完整性。

5. Impact of leading region genes on conjugation

几项研究已经实验调查了先导区基因在细菌接合中的作用。例如，Venturini等人发现两个密切相关的质粒具有相似的接合频率，尽管它们的先导区存在显著差异——一个拥有完整的先导区，另一个缺少很大一部分。此外，从F质粒删除Frpo2（这废除了ssb、psiB和psiA的表达）并不影响两个同基因Escherichia coli菌株之间的转移速率。然而，删除Frpo1启动子或它控制的下游ygeA基因导致接合频率显著降低约73%。YgeA蛋白在接合中的具体功能仍然未知，尽管其明显对高效质粒转移很重要，但这突出了我们理解上的差距。这凸显了标准接合测定在揭示先导区基因细微功能方面的局限性，这些功能可能因各种因素（如受体活性防御系统的 repertoire）而至关重要。确实，Read等人和Chilley和Wilkins证明了ColIB-P9质粒先导区中抗限制基因ardA在克服受体细胞限制屏障方面的重要性。他们的工作表明，当受体表达靶向传入质粒的限制酶时，ardA突变会降低接合效率。最近的工作进一步强调了先导区在应对受体细胞防御方面的重要性。Samuel等人证明，将抗CRISPR基因（acrIIA4）置于Frpo启动子控制下并置于先导区内，当受体采用CRISPR-Cas系统时，能 dramatically 增强接合效率。这些发现强调了先导区在克服受体细胞防御方面的关键作用，并突出了在调查先导区在接合中的作用时考虑这些防御系统的重要性。

6. Conclusion & perspectives

合子表达，由 specialized 启动子或蛋白质易位驱动，对于接合性质粒的成功建立至关重要。这个 tightly 调控的过程，在接合早期启动，允许质粒通过部署在先导区内编码的抗防御机制武器库来克服宿主防御。

合子诱导的瞬时性表明，先导区编码的抗防御因子主要针对对传入质粒瞬时起作用的防御。例如，SOS响应由ssDNA的存在触发，而R-M系统仅在质粒DNA在新宿主中被甲基化之前靶向它。因此，这些防御作为质粒建立的即时“屏障”发挥作用。此外，早期合子表达可能使得抗防御蛋白快速积累，对于有效抵消这些屏障防御至关重要。例如，噬菌体抗CRISPR蛋白的早期表达会快速抑制现有的CRISPR-Cas复合物。在一些系统中，抗CRISPR相关（Aca）蛋白在初始爆发表达后通过抑制进一步调节Acr丰度，类似于在先导区基因中观察到的瞬时表达。

质粒先导区内大部分未表征的基因和调控元件，特别是在研究较少的细菌中，提供了未发现的抗防御系统的丰富来源。专注于这些区域的研究，结合先进的计算方法，有潜力加速发现新颖的抗防御机制并阐明其调控网络。这些知识对于制定控制质粒传播和对抗抗生素耐药性传播的策略可能至关重要。

该研究系统性地总结了接合性质粒为应对宿主防御而在其先导区演化出的复杂合子表达程序，详细阐释了ssDNA启动子和受 repressor 调控的dsDNA启动子两种核心时序调控机制，以及蛋白质易位这一 alternative 策略。研究强调了先导区作为“抗防御岛”集中了多种功能基因（如抗限制蛋白ArdA、SOS抑制蛋白PsiB、ssDNA结合蛋白SSB、甲基转移酶M.EcoGIX、抗CRISPR蛋白Acr及毒素-抗毒素系统），它们通过合子表达在质粒建立的关键早期窗口期快速发挥作用。这些机制共同确保了质粒能够有效克服R-M系统、CRISPR-Cas、SOS响应等主要宿主屏障。研究成果深化了对水平基因转移微观机制的理解，尤其揭示了质粒与宿主在进化博弈中的动态互动，为干预抗菌素耐药性的传播提供了潜在的新靶点和思路，例如通过干扰合子表达程序来抑制质粒的成功建立。