揭示肺炎克雷伯菌致病机制：广宿主生物发光报告载体的构建及其在耐药病原体转录分析中的应用

为解决抗生素耐药性限制基因表达研究工具选择的问题，研究人员开发了四套基于lux操纵子的广宿主启动子探针载体，包含多种抗性标记。研究证实了tolC基因在肺炎克雷伯菌荚膜基因表达中的关键作用，为耐药病原体的实时基因表达分析提供了灵活平台。

　　

抗生素耐药性的全球蔓延不仅给临床治疗带来巨大挑战，也严重制约了基础微生物学研究。随着多重耐药菌株的不断出现，传统遗传标记如氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)等的有效性正在丧失，这使得研究人员在开展基因表达研究时面临选择标记匮乏的困境。与此同时，研究细菌基因表达的传统报告系统如β-半乳糖苷酶(LacZ)和绿色荧光蛋白(GFP)都存在明显局限性：酶促反应需要破坏性样品处理和添加底物化学试剂，而荧光蛋白则需要光激发且易受背景自发荧光干扰。

正是在这样的背景下，细菌生物发光报告系统展现出独特优势。基于lux操纵子的报告系统不需要添加外源底物，能够实现非破坏性的实时监测，且具有高信噪比和宽动态范围。然而，现有lux报告载体通常只包含有限的抗性选择标记，限制了其在耐药病原体中的应用。

为了突破这一瓶颈，Dakshayini G. Chandrashekarappa等研究人员在《Plasmid》杂志上发表了他们的最新研究成果。他们以pBBRlux载体为模板，通过分子工程技术构建了四套新型lux报告载体，这些载体包含潮霉素(Hyg)、四环素(Tet)、新霉素(Neo)和超广谱β-内酰胺酶(SHV-2)等多种抗性选择标记。这些载体采用pBBR1广宿主复制子，能够在不同属的细菌中稳定存在，且与常见质粒复制子如IncP、IncW和ColE1兼容。载体还包含Mob区域，可通过接合转移高效转化到受体细胞中。

研究团队采用的主要技术方法包括：位点特异性诱变引入PstI限制性位点、PCR扩增抗性标记基因、限制性内切酶消化和连接、NEBuilder HiFi DNA组装克隆、接合转移实验以及实时生物发光检测技术。菌株来源包括实验室保存菌株、合作机构馈赠的临床分离株以及已有文献报道的菌株。

3. 结果与讨论

3.1 载体构建与验证

研究人员首先通过位点定向诱变在pBBRlux载体的Cm^R基因5'端引入了一个独特的PstI限制性位点，与3'端已有的PacI位点配合，方便后续抗性标记的替换。成功构建的入门载体被命名为pDC111，在此基础上通过分子克隆技术获得了四个衍生载体：pDC112(Hyg^R)、pDC156(Tet^R)、pDC158(Neo^R)和pDC175(SHV-2)。

这些载体的优势在于提供了多样化的选择标记。潮霉素抗性尤其有价值，因为潮霉素在临床上不常用且不会 confer交叉耐药性。pDC158使用的APH(3')-II等位基因同时 confer对新霉素和卡那霉素的抗性，许多临床分离株对卡那霉素耐药但仍对新霉素敏感。SHV-2等位基因编码超广谱β-内酰胺酶，在固有ampicillin抗性但对cephalosporins敏感的菌株中可作为选择标记。

3.2 广宿主范围验证

为了验证这些载体的广宿主适用性，研究人员将组成型表达的E. coli carA启动子克隆到pDC112中，构建了pDC307(carA-lux)。然后将pDC112和pDC307通过接合转移导入多种细菌属中，包括鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。

结果显示，所有携带pDC307的菌株都产生了显著高于空载体的生物发光信号，证明了这些载体在不同属细菌中的功能性和接合转移效率。这一结果表明pDC112系列载体能够在多种细菌物种中有效评估启动子活性，特别是在抗生素耐药性成为关键考虑因素的情况下。

3.3 tolC在肺炎克雷伯菌荚膜基因表达中的作用

为了展示这些报告载体的应用价值，研究人员研究了tolC基因在经典和高毒力肺炎克雷伯菌株荚膜基因表达中的作用。荚膜生产是肺炎克雷伯菌的关键毒力因子，高毒力菌株产生的多糖有助于形成"超荚膜"，这是高毒力菌株的标志性表型。

研究人员将manC启动子与lux操纵子融合，构建了pDC202(manC-lux)报告载体，并将其导入高毒力菌株KPPR1S及其同源ΔtolC突变体，以及多重耐药经典菌株MKP103及其同源Tn::tolC突变体。结果表明，在KPPR1S ΔtolC突变体中manC表达降低，证实了tolC在高水平manC表达和荚膜生产中的必要性。在经典菌株MKP103中，tolC::Tn突变体也显示出相对于野生型的manC表达减弱，表明tolC与荚膜基因表达之间的联系在两种病理型中可能是保守的。

3.4 实时动力学分析

生物发光报告系统的一个显著优势是能够进行实时动力学分析。研究人员在KPPR1S ΔtolC突变体中进行互补实验，监测了15小时内manC-lux的表达。实验同时使用了pBAD33空载体和pBAD33-tolC互补质粒，与pDC112空载体或pDC202(manC-lux)组合使用。

结果显示，在含有pBAD33和pDC202的ΔtolC突变体中，manC-lux表达从3小时左右开始与野生型分离，并在整个实验过程中保持显著降低。相反，用pBAD33-tolC互补ΔtolC突变体可将manC-lux表达恢复到超过野生型观察到的水平。含有pDC112空载体的菌株只产生背景水平的生物发光，证实观察到的生物发光增加是由于manC启动子的激活。

这些发现表明，tolC对于manC的野生型表达是必需的，而且外源tolC表达显著增加了manC表达，提示在这些测试条件下TolC可能是最大化表达的限制因素。

研究结论与意义

该研究成功构建了一套基于lux操纵子的广宿主启动子报告载体，包含多种抗性选择标记，为抗生素耐药菌的基因表达研究提供了强大工具。这些载体不仅扩展了遗传工具箱，还通过接合转移功能实现了在难以转化的细菌中的广泛应用。

特别重要的是，研究利用这些新载体揭示了tolC基因在肺炎克雷伯菌荚膜基因表达中的关键作用，这一发现在高毒力和经典病理型中均得到验证。荚膜作为肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，其表达调控机制的阐明为开发新的抗菌策略提供了重要见解。

这些lux报告载体的非破坏性、实时监测能力使得研究人员能够在不同条件和时间点精确评估基因表达动力学，包括在动物体内环境中。虽然lux报告系统存在一些局限性，如需要氧气和动物成像中的检测阈值问题，但其在体内外研究中的成功应用表明这些限制并非不可克服。

该研究的创新之处在于解决了抗生素耐药性背景下遗传工具选择受限的实际问题，为研究多种耐药病原体的基因表达调控提供了灵活、高效的技术平台。这些载体的广泛应用将促进对细菌致病机制和耐药性形成的深入理解，为开发新的抗感染治疗策略奠定基础。