Acinetobacter菌Rep_3家族质粒中orfX与dif模块的关联性及进化研究

本研究针对鲍曼不动杆菌中Rep_3家族质粒的进化与传播机制，系统分析了78种R3型质粒，发现35种含orfX的质粒均携带dif模块，揭示了其作为天然dif模块载体的特性。通过AlphaFold 3预测OrfX蛋白结构并提出其可能参与模块移动，为耐药基因传播机制提供了新视角。

　　

在革兰阴性菌耐药性传播中，质粒扮演着关键角色，尤其在鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中，Rep_3家族质粒因其独特的复制机制和携带耐药基因的能力备受关注。然而，这类质粒的进化历程和模块化结构一直缺乏系统研究。早期研究中，位于repA基因下游的一个开放阅读框曾被错误注释为repA，直到近年才被统一命名为orfX，但其功能仍属未知。更引人深思的是，许多Rep_3质粒被发现含有被称为dif模块的移动单元，这些模块通过XerC和XerD重组酶介导的位点特异性重组实现移动，但它们与质粒核心结构的关系尚未明确。

为解答这些问题，研究人员对78种已报道的Rep_3型质粒的代表序列进行系统性分析，聚焦于orfX的存在与否及其与dif模块的关联。研究团队采用生物信息学分析、系统发育重建和蛋白质结构预测等多种方法，包括使用MEGA软件进行RepA和OrfX蛋白的进化树构建（采用Jones-Taylor-Thornton模型和Gamma分布，Bootstrap值1000次），通过AlphaFold 3服务器预测OrfX的三维结构（评估参数包括pLDDT和PAE），并利用PyMOL进行结构可视化。所有质粒序列均从GenBank数据库获取，分析涵盖复制起始蛋白序列比对、pdif位点鉴定和模块边界界定。

3.1. Rep_3质粒骨架中orfX与dif模块的关联

研究发现，35种Rep_3质粒类型（如R3-T1、R3-T4等）均含有orfX基因，且这些质粒的骨架区域均被识别为C型dif模块（即pdif位点呈D/C和C/D取向）。这些骨架包含保守的iteron序列（通常为4-5个21-22 bp重复单元）、repA基因和orfX，末端由XerC/XerD重组位点界定。例如，pMAC（R3-T4）的iterons位于repA上游约97 bp处，而下游150 bp处存在C/D取向的pdif位点。这一结构表明，这些质粒必须至少携带一个D型dif模块才能形成完整的重组位点，从而维持质粒稳定性。

3.2. RepA蛋白的多样性

RepA蛋白的氨基酸长度在295-335 aa之间，序列同一性差异显著（30.58%-95.89%），系统发育分析显示其分为多个亚群，但与orfX的进化关系并不完全一致，表明质粒骨架曾经历广泛重组事件。例如，R3-T1和R3-T17的OrfX蛋白完全一致，但RepA同一性仅60.45%，提示repA和orfX可能独立进化。

3.3. OrfX蛋白的结构与功能线索

OrfX蛋白大小在159-205 aa之间，AlphaFold 3预测显示其包含N端的螺旋-转角-螺旋（HTH）结构域、长的α-螺旋（可能介导二聚化）和无序的C端。二聚化模型提示OrfX可能通过 coiled-coil 结构发挥作用，但其具体功能仍需实验验证。值得注意的是，OrfX与dif模块的严格关联暗示其可能参与模块移动机制。

3.4. Tn1548中的orfX残留

研究发现转座子Tn1548（携带armA氨基糖苷类耐药基因）包含一个残缺的R3-T60型repA和完整的orfX基因，进一步证实Rep_3/OrfX质粒是dif模块的自然来源，且这类模块可能通过IS26等插入序列传播至其他菌属（如肠杆菌科）。

4. 讨论与结论

本研究首次明确定义了Rep_3/OrfX质粒群，揭示其作为dif模块天然载体的核心角色。这些质粒通过XerC/XerD介导的重组实现模块化移动，可能与耐药基因的传播直接相关。OrfX蛋白的保守结构和与dif模块的共生关系提示其功能重要性，需进一步研究其在重组过程中的作用。该发现不仅完善了质粒分类框架，还为理解细菌进化与耐药传播提供了新范式。论文发表于《Plasmid》，为微生物基因组学和抗感染研究提供了重要理论依据。