R3-T33型Acinetobacter质粒骨架变异与dif模块多样性的分子进化研究

本研究系统分析了R3-T33型Rep_3家族质粒的骨架保守性与dif模块多样性，揭示了Acinetobacter质粒通过重组交换和模块融合机制实现抗生素抗性基因（如oxa24、tet39）和毒素-抗毒素系统（如higBA）的水平传播，为理解细菌适应性进化提供了重要分子流行病学依据。

　　

在多重耐药和广泛耐药的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中，抗生素抗性基因主要存在于染色体的复杂抗性区域，但质粒在介导抗生素抗性基因传播中扮演着关键角色。与大肠杆菌（Escherichia coli）、克雷伯菌（Klebsiella）和假单胞菌（Pseudomonas）等革兰阴性病原体不同，Acinetobacter物种特有的质粒类型具有独特的进化特征。其中，编码Rep_3家族复制起始蛋白的质粒是Acinetobacter中最主要的类型，许多这类质粒通过dif模块携带附属基因。这些模块通常包含一个或多个基因，两侧类似于染色体末端特异性重组位点dif的p_dif位点，能够通过XerC和XerD重组酶介导的位点特异性重组实现基因模块的移动、倒位和融合。尽管已鉴定出大量与鲍曼不动杆菌相关的质粒类型，但对其特性尤其是dif模块系统的研究尚不深入。

近期研究发现，Rep_3质粒中最大的群体是那些编码Rep_3家族复制蛋白的质粒，目前已有78种Rep_3类型被报道。这些质粒通常携带一个功能未知的开放阅读框orfX，位于repA基因下游，且许多dif模块含有重要的抗生素抗性基因，如碳青霉烯类抗性基因oxa24和oxa58、四环素抗性基因tet39以及大环内酯类抗性基因msrE-mphE等。此外，还发现携带毒素-抗毒素系统（如higBA基因对）和重金属抗性基因的dif模块。p_dif位点通常以两种相对方向存在：XerC结合位点-间隔序列-XerD结合位点（C/D）或XerD结合位点-间隔序列-XerC结合位点（D/C）。dif模块通常一端为C/D方向p_dif位点，另一端为D/C方向，因此主要分为C模块（XerC结合位点在内）和D模块（XerD结合位点在内），在模块阵列中通常交替出现。

为了深入探究特定Rep_3质粒类型内部的多样性，研究人员对GenBank非冗余数据库中携带R3-T33型rep基因的质粒序列进行了编译和比较。这些质粒来自不同Acinetobacter物种，通过95%repA基因同一性阈值鉴定为R3-T33组。研究重点分析了这些质粒的骨架保守性、dif模块的变异情况以及模块融合现象，旨在揭示这类质粒的进化动态和功能适应性。

研究人员采用生物信息学分析方法，对GenBank数据库（截至2023年10月10日）中携带R3-T33型repA基因的质粒序列进行检索和下载。通过Acinetobacter质粒分型工具鉴定额外repA基因，使用ResFinder识别抗性基因，手动注释p_dif位点和dif模块。利用BLAST进行序列比对，InterPro数据库分析蛋白质保守结构域。对部分样本（如鲍曼不动杆菌J9分离株）进行PCR验证，使用特异性引物扩增p_{dif位点两侧区域，通过测序检测潜在重排事件。}

3.1. dif模块在具有pLUH6050–3相同骨架的R3-T33质粒中的变异

研究发现pLUH6050–3、pKCRI-49-1和13A297n-p1三个质粒具有相同或高度相似的骨架（4648 bp），但dif模块内容存在显著变异。仅一个编码126 aa假设蛋白的小orf模块（orf126）在三者中共同存在。pLUH6050–3携带msrE-mphE（大环内酯抗性）、dfrA44（甲氧苄啶抗性）模块以及四个毒素-抗毒素系统模块（abkBA-tonB-sep、higBA2、higBA3、higBA4），而pKCRI-49-1则含有tet39（四环素抗性）、msrE-mphE、higBA3和ser（丝氨酸重组酶）模块。13A297n-p1包含两个反向的orf257模块和abkBA-tonB-sep模块，无抗生素抗性基因。这些变异表明dif模块的组合具有高度灵活性。

3.2. 毒素-抗毒素模块

质粒中广泛分布毒素-抗毒素基因对，如pLUH6050–3携带四个系统（abkBA、higBA2、higBA3、higBA4），13A297n-p1有两个，pKCRI-49-1有一个。其中abkBA（又称brnTA或splTA）系统已通过实验验证功能，higBA2与功能表征的HigB2/HigA2蛋白具有93-97%氨基酸同一性。higBA3和higBA4为新命名系统，均属于HigB样毒素家族（IPR009241, PF05973结构域）。

3.3. dif模块融合

研究观察到多个模块融合案例。pLUH6050–3中的abkBA-tonB-sep模块显示D位点内部和C位点内部的异常结构，提示由两个模块通过p_dif位点丢失融合而成。PCR实验证实pJ9–3中的abkBA模块可在p_dif位点介导下发生倒位，证明这些位点具有功能活性。另一个sel1-orf170模块（1320 bp）的融合通过94 bp缺失（包含中央p_dif位点）实现，侧翼p_dif位点之一因保守碱基突变（G替换A）可能失活，形成单一大型C模块。

3.4. dif模块的分化

研究发现相同基因内容的模块存在末端或整体序列分化。例如pLUH6050–3与13A297n-p1的higBA2模块在基因下游区域分化（86.84% DNA同一性），长度不同（1395 bp vs 1229 bp）。pLUH6050–3与pMAC的higBA2模块主体高度保守（99.85%），但上游区域分化（89.35%）。pRCH52–2的higBA2模块与pLUH6050–3在higBA2基因区相似（90.99%），但上游更分化，显示模块进化中的局部变异。

3.5. 携带mobA和mobC的质粒骨架中的重组

对FDAARGOS_540p3、pAb01–1和pC9–3等质粒的比较揭示骨架序列存在重组差异。尽管repA基因相同，但mobC和mobA区域呈现显著分化（如FDAARGOS_540p3与pAb01–1在mobC区仅88.30% DNA同一性）。pALWED2.7与pKCRI-49-1的repA-iteron-orfX区高度保守（99.60%），但mobA-mobC区分化（92.29%），表明动员区域通过重组交换积累了变异。

3.6. 缺乏mobA和mobC的质粒骨架

pIC001A和pYH12138–6等质粒具有更分化的repA基因（97.5%和96.9%同一性），且骨架结构完全不同，缺乏mob基因。新发现的p8SAAs470/p8SAAs474质粒（9125 bp）骨架左侧与R3-T43质粒pRCH52–1高度相似，显示跨Rep_3类型的骨架重组事件。

3.7. 其他毒素-抗毒素模块

pAb01–1等质粒携带higBA5系统，与功能表征的HigB2/HigA2蛋白高度同源（100%和97.78%氨基酸同一性）。pAL065–5含有abkBA模块和新型higBA6系统（与HigB4/HigA4相似性43.88%/50.56%）。pIC001A含有higBA2模块，证明毒素-抗毒素系统的广泛分布和功能多样性。

本研究系统揭示了R3-T33型Rep_3质粒在骨架保守性、dif模块组合和进化动态方面的复杂性。尽管repA基因在同一类型内保持高度保守（>95% DNA同一性），但骨架其他区域（尤其是动员基因mobA/mobC）通过重组事件形成镶嵌结构。dif模块呈现高度多样性，包括抗生素抗性、毒素-抗毒素系统和功能未知基因模块，并通过p_dif位点介导的倒位、缺失和融合事件不断进化。多个质粒为共整合体（如pLUH6050–3融合R3-T1和R3-T33骨架），表明不同Rep_3类型质粒间存在动态交互。这些发现不仅深化了对Acinetobacter质粒进化机制的理解，也为临床耐药基因传播的监测提供了分子流行病学框架。该研究发表于《Plasmid》期刊，强调了对细菌可移动遗传元件进行系统分类和功能注释的必要性。