临床抗生素耐药性质粒对大肠杆菌体外生物膜形成和群体生长的影响微弱

本研究针对临床抗生素耐药性(AR)质粒是否影响细菌生物膜形成这一争议问题，通过组合实验方法系统评估了5种临床AR质粒在5种大肠杆菌宿主中的表型效应。结果表明多数质粒-宿主组合中生物膜形成无显著变化，生长成本适中且呈宿主依赖性，揭示了临床质粒对其宿主表型扰动较小，为理解质粒在无抗生素条件下的持久性提供了新见解。

　　

在抗生素耐药性(AR)日益严重的全球公共卫生危机中，耐药性质粒的传播扮演着关键角色。这些移动遗传元件不仅能通过水平转移在不同细菌间传播耐药基因，还可能改变宿主的其他表型特征，其中对生物膜形成能力的影响尤为引人关注。生物膜是细菌附着于表面并分泌胞外聚合物形成的结构化群落，与慢性感染密切相关，并能增强细菌对环境胁迫的抵抗能力。然而，关于AR质粒如何影响生物膜形成，现有研究存在显著矛盾：有些研究发现质粒能显著增强生物膜形成，有些则显示抑制效应，还有些表明无影响。这种不一致可能源于大多数研究只考察单一质粒-宿主组合，且多使用实验室模式菌株和质粒，缺乏对临床相关菌株和质粒的系统评估。

针对这一知识空白，苏黎世联邦理工学院环境系统科学系整合生物学研究所的Laura Brülisauer和Ricardo León-Sampedro在《Plasmid》杂志上发表了一项创新研究。研究人员采用组合实验设计，将五种从住院患者分离的临床AR质粒（包括pESBL1、pESBL15、pESBL25、pKPC和pOXA-48样质粒）分别导入五种大肠杆菌宿主（两种临床分离株和三种实验室菌株），创建了25种质粒-宿主组合，系统评估了这些质粒对生物膜形成和群体生长的影响。

研究采用的关键技术方法包括：通过接合转移技术构建新型质粒-宿主组合；使用结晶紫染色法在LB和M9两种培养基条件下定量生物膜形成；通过微孔板生长曲线分析评估质粒携带的生长成本；运用统计分析方法（双因素方差分析和Welch t检验）评估菌株、质粒及其互作效应。所有临床质粒均分离自巴塞尔大学医院的患者样本，确保了研究的临床相关性。

3.1. 临床抗生素耐药性质粒对生物膜形成的微弱影响

在营养丰富的LB培养基中，研究人员发现质粒引入引起的生物膜形成变化总体微弱，平均相对生物膜形成值为1.14。尽管平均效应较弱，但个体效应强度因质粒和宿主菌株的不同而存在显著差异。在25种组合中，仅三种显示出显著变化，其中最显著的是pESBL25在临床分离株cESBL15中引起的生物膜形成增加214%。然而，后续验证实验表明这一异常结果不可重复，提示需要谨慎解读。排除这一异常值后，平均效应大小降至±11.06%，进一步支持了质粒对生物膜形成影响较小的结论。

3.2. 在最小生长培养基中质粒对生物膜形成的类似微弱效应

在M9最小培养基中进行的独立实验揭示了与LB培养基相似的规律：质粒引入平均不会导致生物膜形成的巨大差异。仅在同一组合（cESBL15携带pESBL25）中检测到显著效应，再次证明质粒效应的高度特异性。值得注意的是，携带rpsL K43R突变的MG1655 + Stm菌株在无质粒情况下表现出最高的生物膜形成能力，且这一特性在质粒获取后保持不变，表明染色体耐药突变可能比质粒编码的耐药性对表型产生更显著的影响。

3.3. 质粒对细菌生长速率的中等宿主依赖性效应

研究人员在无抗生素条件下测量了所有25种质粒-宿主组合的群体生长速率，发现质粒对细菌生长具有中等程度的负面影响：在LB培养基中平均相对最大生长速率为0.94，在M9最小培养基中为0.91。生长成本表现出明显的宿主依赖性，不同宿主菌株对质粒携带付出的平均生长成本存在显著差异。例如，pESBL15在其原始宿主cESBL15中在LB培养基中甚至呈现积极生长效应，而在其他菌株中则相对昂贵。这种菌株特异性效应强调了宿主遗传背景在决定质粒适应性成本中的重要性。

研究结论表明，临床AR质粒在大多数测试组合中对生物膜形成的影响微弱，且这些效应高度依赖于特定的质粒-宿主组合。相比之下，染色体耐药突变（如rpsL K43R）对生物膜形成的影响更为显著。质粒对细菌生长的负面影响也属中等程度，且随宿主遗传背景的不同而变化。这些发现挑战了质粒通常显著改变生物膜形成的传统观念，表明临床AR质粒可能对其宿主细菌仅造成轻微的表型干扰。

讨论部分强调，这些相对温和的表型效应可能有助于解释质粒在无抗生素环境中的持久性。细菌可以在不承担巨大成本的情况下获得这些质粒，这为理解抗生素压力减轻后耐药性的持续存在提供了新视角。研究结果与最近关于耐药性质粒对细菌种群生长具有中等效应的研究一致，支持了临床相关质粒可能经过进化优化以减少对其宿主的适应性成本的假设。

该研究的创新性在于采用了完全因子设计，同时评估了多个临床相关质粒和宿主菌株的组合效应，克服了以往单因素研究的局限性。包括临床菌株和质粒增强了结果的真实世界相关性，因为这些菌株可能携带额外的遗传元素（如原噬菌体、毒力岛），这些元素可能影响新获得质粒的表型效应。

未来研究可扩大测试的质粒-宿主组合范围，考察不同环境条件（包括存在接合转移机会的混合培养条件）下的表型效应，并深入探索质粒与宿主遗传背景相互作用的分子机制。这项工作为理解移动遗传元件在细菌进化中的作用提供了重要见解，特别是在临床环境中抗生素耐药性的出现和传播方面。