单细胞分辨率下分化延迟与休眠特征定义胎肝造血干细胞特性

本研究针对胎肝造血干细胞(FL-HSC)自我更新机制不清的问题，通过构建FL内皮生态位培养体系，结合单细胞技术揭示了具有连续移植能力的FL-HSC亚群独特的分化延迟特性、对称分裂行为和生物合成休眠特征，为造血干细胞扩增提供了新策略。

　　

在生命孕育的奇妙过程中，胎肝（Fetal Liver, FL）扮演着造血中心的关键角色。传统观点认为，胎肝造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）在孕期同时进行快速扩增和分化，既要生成足够的HSCs以维持成年后的终身造血，又要分化产生成熟血细胞支持胚胎发育。然而，近年来的研究逐渐颠覆了这一认知，表明胎肝中可能存在着一群功能独特的HSCs，它们更像是一个“储备军团”，在胎儿时期保持静息状态，延迟分化，直到出生后才被“激活”，贡献于成年期的造血系统。

尽管如此，科学家们仍面临一个核心难题：如何在众多混杂的细胞中，精准地识别出这些具备强大自我更新和长期重建能力的、真正的HSCs？由于缺乏能100%纯化功能性HSCs的表面标志物，即使是表型高度富集的FL-HSCs群体，其内部也存在巨大的功能异质性。解开这个黑箱，对于理解HSCs发育生物学以及实现其在体外的扩增应用于移植治疗至关重要。

为了解决这一问题，由Takashi Ishida、Helong G. Zhao和Brandon Hadland等人组成的研究团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们巧妙地构建了一个能够模拟胎肝血管生态位的体外培养体系，成功实现了具有连续移植能力的FL-HSCs的克隆性扩增。利用这一强大的平台，他们结合单细胞索引流式分选、活细胞成像、移植实验和高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，首次在单细胞分辨率下揭示了那群稀有的、能进行连续移植的FL-HSCs的独特属性：它们表现出显著的分化延迟、倾向于对称性分裂，并拥有独特的生物合成休眠转录特征。这项研究不仅为HSCs的发育生物学提供了新的见解，也为未来开发体外扩增移植级HSCs的策略提供了宝贵的资源和技术平台。

研究人员运用了几个关键的技术方法来开展这项研究。首先，他们从E13.5和E15.5/16.5的小鼠胚胎中分离出胎肝组织，并通过流式细胞术分选获得免疫表型为CD45⁺DAPI^?GR1^?F4/80^?SCA1^highEPCR^high（简称SE^hi）的细胞群体，该群体能高度富集具有长期移植能力的FL-HSCs。其次，他们构建了一个仿生的体外培养体系，利用经过慢病毒转导表达持续活性AKT1的胎肝来源内皮细胞（FL-AKT-ECs）作为滋养层，在无血清培养基中添加干细胞因子（SCF）和血小板生成素（TPO），来支持单个FL-HSCs的克隆性扩增。第三，他们对扩增后的克隆后代进行了多功能分析，包括使用流式细胞术进行免疫表型鉴定、将细胞移植至经清髓性辐照的受体小鼠体内以评估其短期和长期（连续移植）的多系造血重建能力、通过活细胞成像观察和分析细胞最初的分裂行为与对称性。最后，他们对新鲜分选的FL-HSCs以及体外扩增后的克隆细胞进行了单细胞RNA测序，并结合NicheNet等生物信息学算法，深入分析了其转录组异质性以及HSCs与生态位细胞之间潜在的配体-受体相互作用。

Establishment of a clonal HSC amplification platform reveals unique properties of serially engrafting FL-HSCs

研究人员首先优化了FL-HSCs的免疫表型，确定CD45⁺DAPI^?GR1^?F4/80^?SCA1^highEPCR^high（SE^hi）表型能够有效富集早期和中期胎肝中的长期移植活性。通过将单个SE^hi FL-HSCs与FL-AKT-ECs共培养，他们观察到形成的造血克隆在出现时间和细胞组成上存在显著差异。绝大多数克隆在培养早期（第7-12天）出现，并由混合的SCA1⁺EPCR⁺ HSC样细胞和已分化的祖细胞组成。相反，一小部分克隆出现较晚（第12-15天），且几乎完全由SCA1⁺EPCR⁺ HSC样细胞组成，表现出分化延迟的特性。通过将部分细胞进行表型分析，另一部分进行移植实验，他们发现只有这些出现较晚、由均一HSC样细胞组成的克隆才具备连续移植和多系造血重建的能力。这些具备连续移植能力的HSC样克隆其细胞总数也显著少于其他类型的克隆，反映了其相对缓慢的细胞分裂动力学。研究表明，即使在严格表型定义的FL-HSCs群体中，也存在显著的功能异质性，真正的功能性HSCs（能连续移植）的频率远低于仅通过初级移植评估的频率。

Maintenance of SCA1+EPCR+ESAM+ immunophenotype identifies colonies with serial engraftment potential

为了进一步区分具有连续移植潜能的HSC样克隆，研究人员探索了额外的表面标志物。他们发现，尽管内皮细胞选择黏附分子（ESAM）在新鲜的SE^hi FL细胞上普遍表达，但在共培养后，只有那些维持高表达ESAM的SCA1⁺EPCR⁺ HSC样克隆（ESAM⁺ HSC克隆）才具有连续移植能力，而ESAM^?的HSC样克隆则缺乏该能力。这表明，在体外扩增后维持ESAM的表达，可以作为预测FL-HSCs连续移植潜能的一个关键指标。极限稀释移植实验证实，从一个ESAM⁺ HSC克隆能够衍生出多个具备连续移植能力的HSCs，证明FL-AKT-EC生态位支持了功能性HSCs的扩增。

scRNA-seq uncovers transcriptional heterogeneity in immunophenotypic FL-HSCs

通过对新鲜分选的E13.5 SE^hi FL细胞进行scRNA-seq，研究人员在转录水平揭示了该群体的异质性。虽然这些细胞均高表达HSCs相关基因（如Procr（EPCR）、Hlf、Esam、Mecom等），但其表达水平在不同亚群间存在差异。他们发现，一部分细胞表现出低增殖指数，并高表达与成体HSCs休眠、胚胎滞育（diapause）状态、脂质代谢以及化学趋化信号相关的基因特征。相反，另一部分细胞则高表达与代谢和细胞周期激活相关的基因特征，如MYC靶基因、氧化磷酸化相关基因。这种异质性在已发表的E12.5 FL scRNA-seq数据以及人FL-HSCs的数据中也得到验证。这表明，表型定义的FL-HSCs在转录水平上确实存在与生物合成和细胞周期激活状态相关的异质性，其中一小部分细胞表现出与休眠成体HSCs和胚胎滞育相关的特征。

Single-cell transcriptomics identifies transcriptional signatures of self-renewing FL-HSCs with serial multilineage engraftment

研究人员进一步将scRNA-seq技术整合到他们的单细胞功能分析平台中。他们将单个E13.5 SE^hi FL细胞与FL-AKT-ECs共培养，之后对每个克隆的部分细胞进行scRNA-seq，另一部分进行移植，从而将克隆的转录组特征与其功能直接关联。结果显示，唯一一个具备连续移植能力的克隆（克隆2）的细胞，在转录组上显著富集了与成体HSCs休眠、连续移植、胚胎滞育、脂质代谢和化学趋化信号相关的基因特征，而MYC靶基因和HSCs/多能祖细胞（MPPs）激活特征基因的表达水平则显著较低。基因模块分析也鉴定出一个特定的基因模块（模块1），其富含HSCs关键基因（如Hlf、Mecom、Mllt3）以及参与自噬、分解代谢和免疫应答的基因，该模块特异性地在克隆2的细胞中高表达。通过差异表达分析，他们最终定义了一个包含123个基因的“连续移植FL-HSCs基因集”，其中40%的基因与已发表的休眠或连续移植成体HSCs基因集重叠。

Single-cell transcriptomic analysis identifies candidate signaling interactions supporting FL-HSC self-renewal in the FL-AKT-EC niche

为了揭示支持FL-HSC自我更新的外在生态位信号，研究人员利用scRNA-seq数据，通过NicheNet算法分析了FL-AKT-ECs与连续移植HSCs（来自克隆2）之间潜在的配体-受体相互作用。他们预测出了一系列可能调控HSC自我更新和休眠的关键信号通路，包括Notch、TGF-β、Wnt/β-catenin、整合素以及细胞因子/趋化因子（如SCF、CXCL12、IGF1）等。其中，TGFβ1（转化生长因子β1）被预测为最重要的配体之一，其下游调控基因对HSCs休眠和自我更新至关重要。这些预测的信号相互作用在与已发表的体内FL-ECs scRNA-seq数据对比时，也显示出高度的一致性，表明该体外培养体系成功模拟了体内的关键生态位信号。

Live imaging in the FL-AKT-EC niche reveals FL-HSCs undergo symmetric cell divisions

最后，研究人员通过活细胞成像技术直接观察了单个FL-HSCs在FL-AKT-EC生态位中的最初分裂行为。他们发现，最终生成ESAM⁺ HSC克隆（具备连续移植能力）的SE FL细胞，几乎全部进行了对称性细胞分裂（两个子细胞继承的CellTrace荧光强度比值接近1）。而生成其他类型克隆的细胞，其分裂行为则呈现出对称和不对称的广泛分布。这与连续移植FL-HSCs倾向于通过对称分裂进行自我更新的模型相一致。此外，他们发现溶酶体相关膜蛋白3（Lamp3/CD63）在连续移植FL-HSCs中高表达，并且ESAM⁺ HSC克隆主要来源于新鲜FL-HSCs中的CD63⁺群体。CD63此前已被证实与HSCs的分裂对称性、自我更新和休眠有关。

综上所述，本研究通过一个创新的体外功能平台，结合多组学技术，揭示了胎肝造血干细胞群体中一个罕见的、具备连续移植能力的亚群。该亚群独特的性质包括：分化延迟、对称性细胞分裂行为以及一个与生物合成休眠相关的独特转录程序，其特征与成体骨髓中的休眠HSCs和胚胎滞育状态有显著重叠。这些特性由FL内皮生态位提供的复杂信号网络（如TGF-β信号）和HSCs本身固有的程序（如脂质代谢和溶酶体活性）共同调控。这一新的范式表明，胎肝HSCs的扩张并非通过快速增殖和分化同时进行，而是通过一个受控的、相对静止的自我更新过程来实现，这有助于它们在发育过程中避免过度的代谢和基因毒性压力，从而保障其长期功能。本研究定义的免疫表型标志物（SCA1、EPCR、ESAM）和转录特征为在未来研究中识别和分离功能性HSCs提供了强有力的工具，所构建的FL-AKT-EC共培养体系也为在体外扩增用于移植的HSCs以及筛选调控其命运的因子提供了宝贵的平台。最终，这些发现为破解HSCs自我更新的奥秘、开发新的造血干细胞治疗策略奠定了坚实的基础。