核仁应激通过劫持DNA损伤应答通路驱动胰岛β细胞衰老的新机制

本研究揭示了核仁应激在胰岛β细胞衰老中的关键作用。研究人员针对糖尿病进程中β细胞功能衰退的机制问题，开展了核仁应激与β细胞衰老关系的主题研究，发现核仁应激通过激活γ-H2AX/ATM通路（不依赖DNA双链断裂）诱导β细胞衰老，ATM抑制剂可显著缓解此过程。该研究为糖尿病治疗提供了新的靶点策略。

　　

糖尿病作为一种慢性代谢综合征，其特征是持续高血糖和胰岛素分泌不足，已成为全球性的健康问题。糖尿病主要分为1型和2型，两者都涉及进行性的胰岛β细胞功能障碍和丢失。在高糖、促炎细胞因子和饱和脂肪酸等不利刺激下，β细胞会发生多种病理改变，包括凋亡、衰老和自噬。过去二十年的研究表明，细胞衰老在β细胞功能障碍中扮演着重要角色，但β细胞衰老在糖尿病发病机制中的作用复杂且具有环境依赖性。

尽管代谢应激已被证明通过DNA损伤应答（DDR）激活促进β细胞衰老，但其潜在机制尚未完全阐明。值得注意的是，代谢应激诱导的DNA双链断裂（DSBs）由于其高细胞毒性，通常与β细胞凋亡而非衰老相关。新兴研究强调了新型应激感应机制的作用，如核仁应激，它将各种应激信号与DDR通路联系起来，特别是通过p53信号激活。

核仁应激是一种由于核糖体RNA（rRNA）转录中断和核仁形态改变引起的细胞应激事件，可由营养剥夺、缺氧、DNA损伤、氧化和热应激等多种应激刺激触发。核仁应激可通过影响细胞命运和疾病进展的多种信号通路，在调节细胞凋亡、早衰和自噬中发挥作用。虽然rRNA合成受到多种代谢信号通路（如AMPK、mTOR和Sirt1）的严格调控，但核仁应激在代谢疾病发展中的具体作用仍 largely unexplored。

在这项发表于《iScience》的研究中，Yaqi Jiao等人深入研究了核仁应激在胰腺β细胞生理学中的作用，并确定其为β细胞衰老的关键驱动因素。研究人员运用了多种关键技术方法，包括：使用高脂高胆固醇（HFHC）饮食诱导的糖尿病小鼠模型；通过化学抑制剂CX-5461和ActD诱导核仁应激；采用免疫组化、免疫荧光和Western blotting分析衰老标志物和核仁应激标志物；通过SA-β-gal染色评估细胞衰老；利用EdU掺入实验检测细胞增殖；采用ELISA法分析SASP因子分泌；以及通过shRNA敲低技术进行基因功能缺失研究。实验使用了小鼠β-TC-6细胞、大鼠INS-1细胞以及从C57/B6小鼠分离的原代胰岛细胞。

代谢应激诱导衰老过程中核仁畸变的出现

研究人员首先评估了代谢应激诱导的β细胞功能障碍和衰老是否涉及核仁畸变。经过12周HFHC饮食喂养后，小鼠体重显著增加，胰岛组织中出现明显的高血糖特征和细胞衰老特征。免疫组化分析显示，与普通饮食小鼠相比，HFHC小鼠胰腺胰岛中衰老标志物p16和p21的表达显著增加。

通过透射电子显微镜（TEM）和嗜银核仁组织区分析，研究人员发现HFHC小鼠的胰岛细胞每个细胞中的核仁数量显著增加，表明代谢应激后胰岛细胞的核仁可能更加碎片化。相应地，在HFHC喂养小鼠的胰岛细胞中观察到核仁蛋白（NPM）从核仁到核质的扩散显著增强，这是核仁应激的标志现象。这一现象在培养的β细胞中使用已建立的应激诱导剂（棕榈酸和H₂O₂）处理得到了重现。值得注意的是，基因集富集分析（GSEA）显示，在小鼠衰老胰岛细胞中，参与核仁应激的基因集显著上调。这些发现提示核仁应激可能在胰腺胰岛衰老过程中起到促进作用。

暴露于核仁应激诱导剂CX-5461和ActD触发胰腺β细胞的衰老表型

为了解读核仁应激在诱导β细胞衰老中的作用，研究人员在两种已建立的胰腺β细胞系（小鼠β-TC-6和大鼠INS-1细胞）中检测了衰老表型。他们使用两种已建立的RNA聚合酶I（Pol I）化学抑制剂CX-5461和ActD来诱导核仁应激。这两种化合物在适当浓度下选择性靶向核糖体DNA并抑制Pol I介导的rRNA转录。

SA-β-gal染色显示，两种核仁应激诱导剂均以剂量依赖的方式显著驱动β细胞的衰老表型。重要的是，在这些剂量范围内，研究人员没有通过TUNEL染色观察到任何β细胞凋亡的证据。此外，他们检测了β-TC-6细胞中已建立的衰老标志物水平，包括p16、p19和p21，发现在CX-5461暴露后这些蛋白水平显著增加，在mRNA水平也获得了类似结果。

细胞衰老的定义特征之一是细胞增殖的不可逆停止。EdU掺入实验显示，核仁应激刺激剂导致增殖细胞数量显著下降，而不涉及细胞死亡。值得注意的是，两种细胞类型中白细胞介素（IL）-1β和IL-6的水平（SASP的标志成分）显著升高，这表明细胞衰老明显开始，并进一步支持了核仁应激诱导可以触发已建立β细胞衰老表型的假设。

通过TIF-IA耗竭遗传抑制rRNA合成诱导β细胞衰老

为了阐明核仁应激在β细胞衰老中的具体作用，研究人员研究了遗传诱导的核仁应激是否也会触发β细胞衰老。RNA Pol I machinery的rRNA转录需要多个必需的转录辅因子，包括转录起始因子IA（TIF-IA/Rrn3）和上游结合因子。破坏它们的表达可以有效损害rRNA合成并诱导核仁应激。

研究人员生成了靶向小鼠TIF-IA的慢病毒短发夹RNA构建体，并将其转导到β-TC-6细胞中。与乱序shRNA对照相比，TIF-IA特异性shRNA有效降低了TIF-IA mRNA和蛋白水平。TIF-IA耗竭显著降低了所有主要rRNA物种（18S、28S和5.8S rRNA）的水平，而不影响看家基因Eif1的表达，这表明rRNA转录的特异性抑制。

与化学诱导的核仁应激一致，TIF-IA耗竭显著增强了SA-β-gal活性，并提高了衰老标志物的表达，包括p16、p21和p53。这些结果表明，通过TIF-IA耗竭遗传抑制rRNA转录可诱导核仁应激和β细胞衰老。

核仁应激诱导的β细胞衰老涉及γ-H2AX焦点形成

为了进一步阐明核仁应激诱导β细胞衰老的分子机制，研究人员检测了CX-5461和ActD暴露后β细胞的分子改变。由于核仁应激与DDR通路的激活密切相关，他们研究了核仁应激是否可能导致DDR的分子改变。

具体来说，他们使用抗γ-H2AX抗体分析了DNA损伤焦点的形成。正如预期的那样，CX-5461暴露以剂量依赖的方式在β细胞中引起明显的γ-H2AX焦点形成，特别是在CX-5461剂量为100-500 nM范围内。同样，ActD处理在0-8 nM剂量范围内产生了类似的γ-H2AX焦点增加。这些发现在INS-1细胞中得到了验证。

核仁应激诱导的DNA损伤标志物不依赖于DNA链断裂

鉴于γ-H2AX是DNA双链断裂（DSBs）的敏感标志物，研究人员试图验证核仁应激是否确实诱导了DNA损伤。他们使用了彗星试验来检测DNA链断裂。与依托泊苷（一种已知的DSB诱导剂）相比，CX-5461暴露没有引起明显的DNA尾巴形成，表明没有可检测到的DSBs。

此外，他们评估了其他DNA损伤标志物的水平，如p-ATR和p-Chk1。Western blot分析显示，CX-5461暴露没有增加p-ATR或p-Chk1的水平。这些数据共同表明，核仁应激诱导的γ-H2AX焦点形成可能不依赖于经典的DNA损伤途径，而是代表了一种"伪DDR"现象。

ATM激活介导核仁应激诱导的β细胞衰老

接下来，研究人员试图确定核仁应激诱导的伪DDR中涉及的具体信号通路。他们重点关注了ATM激酶，这是DDR中的关键调控因子，已知可磷酸化多种底物，包括H2AX、p53和Chk2。

Western blot分析显示，CX-5461暴露以时间依赖的方式显著增强了ATM在Ser1981位点的磷酸化（p-ATM）。为了确定ATM激活在核仁应激诱导衰老中的功能作用，他们使用了特异性ATM抑制剂KU60019。Western blot分析证实，KU60019有效阻断了CX-5461诱导的ATM磷酸化。

与单独使用CX-5461处理的细胞相比，KU60019共孵育显著减弱了SA-β-gal活性。Western blot分析显示，p16、p19和p21的升高水平在KU60019存在下被显著抑制。此外，与单独使用CX-5461处理的细胞相比，KU60019共孵育后细胞增殖能力恢复，且通过台盼蓝测定未检测到细胞活力降低。此外，细胞中IL-1β和IL-6的升高水平在KU60019处理后减弱。这些结果突出了ATM激活在核仁应激诱导的β细胞衰老中的关键作用。

核仁应激在原代胰岛细胞中诱导γ-H2AX焦点形成并上调p53和p16

为了验证核仁应激在诱导胰岛β细胞衰老程序中的作用，研究人员从C57/B6小鼠中分离出原代胰岛，并将其暴露于CX-5461中72小时。正如预期的那样，与载体对照相比，CX-5461暴露导致γ-H2AX焦点形成显著增加。此外，对衰老标志物的检查显示，p53和p16蛋白水平显著上调。

讨论与结论

本研究提供了令人信服的证据，表明核仁应激是β细胞衰老的关键上游事件。研究人员证明，在代谢应激条件下，衰老的β细胞表现出核仁形态改变和核仁蛋白NPM的重新分布。通过化学和遗传方法抑制rRNA合成，有效诱导了β细胞衰老，表现为SA-β-gal活性增加、衰老标志物上调和SASP分泌。值得注意的是，核仁应激还独立于DSBs诱导了γ-H2AX焦点形成和ATM激活。ATM的药理学抑制强烈减弱了核仁应激诱导的β细胞衰老。

这些发现与先前的研究一致，表明核仁应激是细胞衰老的关键驱动因素。例如，在血管平滑肌细胞中，核仁应激诱导了衰老样表型并促进了血管变性的发展。同样，NOL12抑制诱导了核仁应激驱动的细胞衰老，并与规范性衰老有关。SIRT7作为一种表观遗传调控因子，通过维持rDNA稳定性来防止细胞衰老。

过去几十年的研究已经充分证明，核仁是各种应激信号的传感器，特别是在基因组稳定性监测中。DNA损伤可能破坏rRNA的转录，导致核仁结构改变和核仁应激的启动，这对于监测基因组完整性至关重要。一些研究揭示，核仁应激对于在基因毒性应激下激活多种DDR通路（如p53、PCNA、ATM和RAD51）至关重要。值得注意的是，通过化学或遗传抑制rRNA转录诱导的核仁应激可能激活这些DNA损伤相关通路，即使在没有DSBs或其他形式的DNA损伤的情况下也是如此。

作为DDR中涉及的关键激酶，ATM已被充分证明在衰老调控中扮演关键角色。ATM可能通过断言底物蛋白（如p53、p53结合蛋白1、γ-H2AX、检查点激酶-2和nibrin/NBN）驱动衰老程序。一致地，研究人员证明了ATM在核仁应激诱导的β细胞衰老中的关键作用，并发现ATM抑制消除了核仁应激后的β细胞衰老表型。然而，细胞衰老过程中ATM激活的机制仍然难以捉摸。

总之，本研究结果表明，核仁应激通过伪DNA损伤和ATM激活促进β细胞衰老。在代谢应激诱导的衰老β细胞中观察到核仁应激，表明核仁应激在糖尿病进展过程中β细胞恶化中广泛参与。ATM阻断强烈减弱了核仁应激诱导的衰老表型，突出了靶向ATM作为在代谢应激下防止过度β细胞衰老和丢失的可行方法。这些数据共同强调了阻断核仁应激介导的ATM信号以保护β细胞功能和预防糖尿病进展的治疗潜力。

该研究也存在一些局限性。首先，研究范围局限于体外细胞模型和特定的体内代谢应激条件，没有在不同糖尿病亚型或临床标本中进行验证，可能限制了转化相关性。其次，虽然观察到核仁应激后γ-H2AX焦点形成，但这一过程的精确分子机制仍未解决，不能排除与其他应激通路（如氧化应激或内质网应激）的潜在相互作用。第三，通过表型和信号改变表征了核仁应激对ATM的激活，但将ATM与衰老联系起来的上游调控因子和下游效应子仍未解决，为未来研究留下了关键机制空白。最后，该研究仅限于对雄性来源胰岛的研究。性别和性激素是胰岛细胞功能（包括β细胞衰老）的公认调节因子，先前的研究表明雄性通常更容易出现β细胞功能障碍和衰竭。虽然研究结果在雄性小鼠和原代胰岛培养中证明了核仁应激与胰腺β细胞衰老之间的强关联，但雌性性别在多大程度上提供保护仍不清楚，值得进一步研究。