三维微肿瘤药物筛选揭示癌症相关成纤维细胞中DDR1/2-MAPK12-GLI1信号轴作为治疗新靶点

本研究针对肿瘤微环境（TME）复杂细胞互作导致传统二维培养模型难以发现有效靶点的问题，通过三维微肿瘤药物筛选结合机器学习分析，发现doramapimod通过靶向CAFs中DDR1/2-MAPK12-GLI1非经典 Hedgehog 信号轴，抑制ECM重塑并增强化疗/免疫疗效，为靶向TME提供了新策略和验证平台。

　　

在肿瘤治疗领域，一个长期存在的难题是：为什么在实验室培养皿中效果显著的抗癌药物，进入人体后往往黯然失色？答案可能隐藏在肿瘤微环境（TME）的复杂生态中。实体肿瘤并非仅仅是癌细胞的简单集合，而更像一个 dysfunctional 的器官，由恶性细胞、非恶性宿主细胞和复杂的细胞外基质（ECM）共同构成。这种复杂的细胞间相互作用深刻影响着治疗反应和耐药性的产生。然而，传统的肿瘤研究方法——使用培养的癌细胞系或皮下移植肿瘤细胞——无法重现肿瘤细胞与基质细胞、细胞与ECM之间复杂的相互作用。

特别值得注意的是癌症相关成纤维细胞（CAFs），这些被癌细胞招募和重编程的基质细胞，通过产生富含胶原的ECM，为肿瘤生长提供物理支持和信号引导。在高度纤维化的肿瘤类型，如三阴性乳腺癌（TNBC）和胰腺癌中，CAFs形成的致密基质不仅促进肿瘤进展，还构成了化疗和免疫治疗的物理屏障。尽管靶向经典Hedgehog信号通路的尝试在胰腺癌治疗中未能改善患者生存，但基质细胞在肿瘤微环境中的关键作用仍然提示我们需要寻找新的治疗策略。

为了解决这一挑战，研究人员在《Cell Reports Medicine》上发表了一项创新性研究，他们采用了一种整合器官型肿瘤切片培养系统、表型测量和机器学习建模的方法，能够在生理相关的肿瘤微环境中测试和预测药物反应。该研究通过对比二维培养和三维微肿瘤模型的药物筛选结果，发现了一个针对肿瘤微环境的新型治疗靶点——DDR1/2-MAPK12-GLI1信号轴。

研究人员主要运用了以下关键技术：三维微肿瘤培养技术（从新鲜肿瘤标本制备保留组织结构的微肿瘤）；基于机器学习的激酶正则化（KiR）建模（使用弹性网络回归连接表型结果与激酶活性）；功能激酶抑制剂筛选（测试32种计算选择的激酶抑制剂）；体内外药效验证（使用免疫 competent 小鼠模型和患者来源异种移植模型）；转录组和蛋白质组分析（RNA测序和质谱-based ECM蛋白质组学）；以及单细胞RNAseq分析（来自公共数据库的胰腺癌数据）。

比较二维培养和三维组织筛选识别出靶向肿瘤微环境的药物

研究人员首先进行了对比性药物筛选，分别在单层细胞（二维培养）和肿瘤组织（三维微肿瘤）上测试药物效果。这些微肿瘤直接来自新鲜肿瘤标本，保留了多种天然细胞类型，包括基质和免疫成分，以及ECM和整体组织结构。利用机器学习驱动的药物筛选方法，他们在原位免疫 competent 的乳腺和胰腺肿瘤组织以及同源的二维培养细胞系上进行了激酶抑制剂筛选。

研究使用了三种 established 的小鼠模型，这些模型以TME对癌细胞行为和治疗反应的显著影响而闻名，包括富含基质的TNBC（E0771和Py8119）和胰腺癌（KPC）模型。实验测试了32种计算选择的激酶抑制剂，并评估了它们对二维和微肿瘤中癌细胞活力的影响。表型数据与先前建立的激酶抑制剂谱和弹性网络回归建模相结合，这种方法被称为激酶正则化（KiR），用于预测428种激酶抑制剂的反应。

研究发现在所有三种情况下，平均而言，对微肿瘤有效的抑制剂数量是对二维培养细胞有效的抑制剂数量的2-3倍。当比较对微肿瘤有效的激酶抑制剂反应的重叠时，研究人员观察到两个TNBC模型之间的重叠（29种药物）高于胰腺肿瘤模型（18-21种药物）。研究人员随后研究了特异性对微肿瘤有效但对二维培养中癌细胞活力没有影响的药物。

Doramapimod在多种癌症模型中抑制肿瘤生长

由于doramapimod在癌症中的作用尚未明确，研究人员使用来自多种模型的微肿瘤评估了其在TME中的效果，包括小鼠肿瘤（KPC、4T1、Py8119和E0771原发及肺转移）、乳腺癌患者来源异种移植（PDX）（HCI-001）以及人类肿瘤（肝细胞癌和脑膜瘤）。研究发现，doramapimod治疗显著降低了来自纤维化肿瘤（如TNBC和胰腺癌）的微肿瘤活力，而在其他肿瘤类型如HCC和脑膜瘤（通常具有较少致密基质）中效果有限，表明doramapimod的作用机制可能涉及纤维化基质细胞类型。

接下来，研究人员在体内评估了doramapimod的治疗潜力，使用了生理相关的小鼠模型。他们在TNBC（E0771和4T1）、胰腺癌（KPC）和TNBC PDX模型（HCI-001）中测试了其抑制肿瘤生长的能力。研究发现全身给予doramapimod能够抑制E0771乳腺肿瘤和KPC胰腺肿瘤的生长。为了最小化系统暴露并测试其抗肿瘤效果是否源于局部作用而非系统抗炎活性，研究人员在免疫 competent（4T1）和免疫缺陷（HCI-001 PDX）小鼠模型中进行了瘤内给药。瘤内给予doramapimod显著抑制了两种模型中的肿瘤生长。

Doramapimod治疗改变细胞外基质组成并影响癌症相关成纤维细胞功能

为了研究doramapimod的作用机制，研究人员分析了用doramapimod与 vehicle control 处理的KPC和E0771肿瘤中的转录组变化。Doramapimod治疗显著降低了80-84个基因的表达（≥2倍，p<0.05），包括col1a1（2.1倍）、loxl2（3.0倍）和agt（5.3倍）。通路和GO分析显示，与ECM组织、金属蛋白酶和胶原过程相关的基因富集。为了在蛋白质水平验证这些变化，研究人员对处理过的肿瘤进行了ECM-focused 蛋白质组学分析。

ECM，特别是胶原蛋白，在癌细胞存活、增殖和侵袭中起着至关重要的作用。在纤维化肿瘤中，CAFs是ECM生产的主要贡献者。这些成纤维细胞被癌细胞招募和重编程，通过产生富含胶原的ECM来促进肿瘤生长。支持这一点的是，基于xCell的反卷积分析显示，在doramapimod治疗后，4T1和KPC肿瘤中的CAF群体减少。

为了评估doramapimod如何影响CAFs功能，研究人员利用了从人类乳腺和胰腺肿瘤中分离的CAFs。Doramapimod对CAF生长或活力没有影响，但转录组分析显示，在乳腺CAFs中显著下调了1,153个基因，包括ECM相关基因，如胶原蛋白、基质金属蛋白酶、CXCL12（2.4倍，p=1.5E-41）和SPP1（14倍，p=1.5E-181）。在胰腺CAFs中也观察到COL1A1、COL1A2和ACTA2的类似减少。通路分析显示ECM相关过程富集，包括整合素信号、胶原降解和弹性纤维形成。

Doramapimod靶向DDR1/2和MAPK12激酶调节癌症相关成纤维细胞中的ECM

为了研究doramapimod介导的CAFs中ECM调节的分子机制，研究人员首先旨在识别其直接蛋白靶点。他们使用HotSpot放射性滤膜结合方法进行了体外激酶 assay，在Km ATP条件下分析了doramapimod对370种激酶在500 nM浓度下的抑制情况。这一 assay 确认了doramapimod的已知靶点，包括p38α（MAPK14）（残留活性0.2%，或99.8%抑制）、p38β（MAPK11）（残留活性19%）和p38γ（MAPK12）（残留活性15.4%），与先前报道一致。

出乎意料的是，研究人员还发现了doramapimod对先前未关联的激酶的强效抑制，包括discoidin domain receptor 1（DDR1）（残留活性0.1%，表明99.9%抑制）、DDR2（残留活性3.9%，或96.1%抑制）、JNK2（MAPK9）（残留活性7.8%）和EphrinA7（残留活性1.6%）。由于EphrinA7在CAFs中不表达，因此被排除在进一步分析之外。

这些发现使研究人员提出假设：doramapimod对CAFs的影响可能是由抑制p38 MAPKs、JNK2和DDR1/2激酶驱动的。为了验证这一点，他们使用沉默RNA降低了乳腺癌来源CAFs中这些激酶的水平，并测量了CAF标志物的表达。敲低DDR1或MAPK12显著降低了ACTA2（一种肌成纤维细胞样CAF标志物），而沉默DDR1、DDR2或MAPK12减少了CXCL12表达（与炎症型CAFs相关）。值得注意的是，敲低DDR2增加了ACTA2，表明可能存在补偿效应。

DDR1/2-MAPK12信号轴对CAF介导的癌细胞生长至关重要

CAFs通过直接接触和旁分泌信号与TME中的邻近细胞相互作用。先前的研究表明，CAFs可以在无血清条件下促进癌细胞生长。为了测试来自乳腺和胰腺肿瘤的CAFs是否支持癌细胞生长以及doramapimod是否能破坏这种支持，研究人员进行了共培养实验。他们发现，4T1乳腺癌细胞在单独培养时在无血清条件下无法增殖，但与乳腺来源的CAFs共培养时能够生长，表明CAFs通过接触和分泌因子促进癌细胞生长。

值得注意的是，doramapimod处理以剂量依赖性方式减少了CAFs存在下的4T1增殖。在与成纤维细胞共培养的MDA-MB-231人TNBC细胞中也观察到类似结果，表明doramapimod破坏了CAF介导的癌细胞生长支持。

接下来，研究人员调查了哪些doramapimod靶向激酶介导了CAFs支持癌细胞生长的能力。他们在乳腺癌来源的CAFs中降低了六种被鉴定为doramapimod靶点的激酶水平，并评估了它们在血清剥夺条件下支持乳腺癌细胞生长的能力。研究发现，敲低DDR1、DDR2和MAPK12（p38γ）显著降低了CAF介导的癌细胞生长支持，而沉默其他激酶没有效果。

GLI1，hedgehog通路转录调节因子，控制DDR1/2-MAPK12轴下游的ECM基因表达

研究人员的数据表明，DDR1/2-MAPK12在调节CAFs中的ECM基因中起着重要作用。然而，这些受体和激酶调节ECM基因和支持癌细胞生长的机制，以及哪些转录因子参与其中，仍不清楚。为了进一步阐明这一通路的机制细节，他们检查了响应DDR1/2和MAPK12敲低在CAFs中下调基因的重叠。

研究人员发现了7个基因的重叠，这些基因通常因DDR1/2和MAPK12的敲低而减少至少2倍。这些包括几个参与免疫细胞调节的基因，如CXCL12、CCL11和PTGS1，以及胶原（COL15A1）和神经胶质瘤相关癌基因同源物1（GLI1）。值得注意的是，GLI1是唯一被发现因DDR1/2或MAPK12敲低而下调的转录因子。

Doramapimod在临床前模型中提高化疗和免疫治疗的效果

CAFs是TME的关键组成部分之一，为癌细胞提供物理支持，并在促进胰腺癌的肿瘤发生和化疗及免疫治疗抵抗中起关键作用。因此，通过抑制CAF功能，可以设想增强对化疗和免疫治疗的反应。与来自KPC微肿瘤的发现一致，研究人员发现，用doramapimod处理人类胰腺肿瘤切片显著增加了凋亡，通过cleaved caspase-3染色测量，与DMSO处理的切片相比。

此外，doramapimod治疗增强了吉西他滨在人类PDAC切片中的效果。在KPC肿瘤模型切片中也观察到类似结果。Masson三色染色证实，doramapimod处理降低了PDAC切片中的胶原水平，支持其涉及ECM重塑的作用机制。

许多研究表明，致密的ECM可以充当物理屏障，限制化疗在胰腺癌中的有效性。为了测试doramapimod介导的ECM重塑是否能够增强吉西他滨疗效，研究人员处理了来自原位生成的KPC肿瘤的肿瘤切片。虽然doramapimod单独降低组织活力，吉西他滨效果很小，但联合治疗显著降低了整体组织活力。

为了在体内验证这些发现，研究人员使用了原位KPC胰腺肿瘤模型，并用 vehicle、doramapimod、吉西他滨或组合治疗小鼠。Doramapimod和吉西他滨单独使用导致肿瘤重量与 vehicle 相比部分减少（分别为p<0.01和p<0.05）。值得注意的是，联合治疗导致肿瘤负荷急剧减少，最终肿瘤重量小于单药组的一半（与 vehicle 相比p<0.0001）。

最近的研究表明，DDR1促进胶原纤维排列，导致免疫排斥。此外，DDR1/2激酶与中性粒细胞胞外陷阱的形成有关，促进PDAC肿瘤进展和转移。因此，研究人员假设DDR1/2激酶通过促进ECM释放和排除免疫细胞在塑造TME中至关重要。

支持这一点的是，对doramapimod治疗在E0771和KPC肿瘤中上调基因富集通路的分析显示，与抗肿瘤免疫相关的生物过程显著富集，包括干扰素-γ信号和细胞因子信号。一致地，研究人员观察到在用doramapimod处理的免疫"冷"KPC和E0771肿瘤中，CD8⁺ T细胞浸润显著增加。

受此启发，研究人员进行了定量多重免疫组化化学评估更广泛的免疫景观。Doramapimod治疗导致CD3⁺ T细胞显著增加和Ly6G⁺中性粒细胞减少，同时F4/80⁺巨噬细胞适度增加。CD11b⁺或CD11c⁺群体未见显著变化。

鉴于CD8⁺ T细胞浸润增加，研究人员接下来询问doramapimod是否能够增强免疫检查点阻断的疗效。在来自E0771模型的离体肿瘤切片中，低剂量doramapimod与抗PD-L1或抗PD-1的联合治疗显著优于任一单药。为了在体内验证这一点，研究人员进行了E0771肿瘤的原位植入，并用doramapimod、抗PD-L1或它们的组合治疗小鼠。Doramapimod单独在7只小鼠中的5只中产生部分肿瘤生长抑制，而抗PD-L1单独在所有5只小鼠中导致部分反应。显著的是，联合治疗在6只小鼠中的3只中导致完全肿瘤生长抑制，其余3只部分反应。

研究结论与意义

这项研究揭示了肿瘤微环境靶向治疗的新视角，通过创新的三维微肿瘤筛选平台发现了DDR1/2-MAPK12-GLI1这一 previously unrecognized 信号轴。该研究不仅提供了一种高效识别TME特异性药物的方法，还深入阐明了doramapimod通过靶向CAFs中非经典Hedgehog通路发挥抗肿瘤作用的机制。

研究发现的意义在于：首先，它证实了三维微肿瘤模型在药物发现中的优越性，能够识别出在传统二维筛选中被忽略的TME靶向药物；其次，它揭示了DDR1/2-MAPK12-GLI1轴在CAF功能调节中的核心作用，为克服基质相关治疗抵抗提供了新靶点；最后，它证明了靶向这一通路能够增强化疗和免疫治疗的效果，为联合治疗策略提供了理论依据。

特别是针对临床失败的Hedgehog通路抑制剂，这项研究提出了新的解释：传统的SMO抑制剂可能无法有效抑制CAFs中非经典的GLI1激活途径。而直接靶向GLI1或其上游调节因子如DDR1/2-MAPK12可能是更有效的策略。Doramapimod作为一种同时抑制DDR1/2和MAPK12的药物，能够广泛抑制功能多样的CAF亚型，这可能是其有效性的关键。

这项研究的发现不仅为肿瘤微环境靶向治疗提供了新的科学依据，也为临床转化提供了有前景的候选药物和联合治疗策略。未来研究需要进一步探索DDR1/2-MAPK12-GLI1轴在不同肿瘤类型中的普遍性，以及doramapimod在临床患者中的疗效和安全性。