RESPAN：集成深度学习的自动化树突棘形态分析平台推动神经科学研究

本刊推荐：RESPAN（Restoration Enhanced Spine and Neuron Analysis）作为集成深度学习（DL）的自动化分析平台，通过内容感知恢复（CARE）和自配置神经网络（nnU-Net）技术，实现了对树突棘（dendritic spines）的高精度三维分割与量化分析。该平台突破传统方法在通量、重现性方面的局限，支持多模态成像数据（包括双光子/共聚焦显微镜），为研究神经发育障碍（如SRGAP2+/?模型）和突触可塑性提供了强大工具。

　　

引言

树突形态和突触输入连接是定义神经元亚型及其功能特性的核心特征。在哺乳动物新皮质中，锥体神经元（PNs）接收的大部分兴奋性突触输入位于树突棘上，这些小型突起由圣地亚哥·拉蒙-卡哈尔首次描述。树突棘密度和分布的分析数十年来一直被用作关键解剖学指标，用于评估发育期和成年期不同PN亚型在生理和病理环境中的兴奋性输入，包括神经发育障碍和 neurodegeneration。此外，在成年皮质和海马主要神经元中，棘头大小与突触后AMPA受体含量和突触强度紧密相关，使棘尺寸成为突触成熟的关键指标。

尽管近期深度学习（DL）方法提升了树突棘映射能力的准确性，但其效用仍受功能有限和分析读数的限制。现有方法如Vaa3D、SpineTool和Imaris缺乏跨数据集的鲁棒性和可扩展性，且对信号和图像质量变化高度敏感。因此，全自动化很少实现，因为每张图像通常需要大量手动干预进行参数优化和后处理校正。这种对人工调整的依赖限制了效率，并引入了人为错误和偏见。

RESPAN的开发

为应对这些挑战，研究团队开发了 restoration enhanced spine and neuron analysis（RESPAN），一个用于神经元和树突棘自动化分析的集成解决方案。RESPAN结合了最先进的DL方法，用于内容感知图像恢复、增强轴向分辨率和鲁棒的三维分割，所有功能均集成在单一用户友好界面中。该流程在精确分割棘头、棘颈、树突分支和胞体之前，改善了信噪比、对比度和空间分辨率。与现有工具不同，RESPAN通过直观的图形用户界面（GUI）操作，消除了编码要求，并在单个应用程序中无缝集成多个软件环境，允许进行分析、验证和模型训练。此外，RESPAN生成全面的读数，包括视觉和表格化数据，详细描述树突棘形态、信号强度和空间指标，以及用于时间分析的单个棘跟踪。

RESPAN工作流程概述

RESPAN流程整合了GPU图像处理和多种DL方法，以实现高通量荧光图像恢复、分割以及树突分支和树突棘的分析。通过集成内容感知恢复和三维卷积神经网络分割，RESPAN提高了棘检测的准确性和对形态变化的敏感性，特别是在具有挑战性的实验条件下，如体内双光子显微镜和大组织体积的快速体积成像。为确保广泛可访问性，RESPAN既作为Python代码提供，也作为具有直观统一GUI的独立Windows应用程序提供，允许用户在同一界面内运行批量分析、训练模型和执行分析验证。将这些功能和多个软件环境结合在一个界面中，显著提高了效用，并减少了无编程专业知识的研究人员的障碍。

深度学习图像恢复（可选步骤）

在分割之前，RESPAN提供执行图像恢复以增强信号质量和对比度的选项。这对于在光毒性和时间分辨率要求限制图像质量的具有挑战性的成像条件下准确检测棘至关重要。为实现这一目标，RESPAN采用了三维内容感知CSBDeep模型，使用配对的低和高信噪比（SNR）图像体积进行训练。研究团队在各种样本中获取这些图像集，以最好地反映成像条件和生物特征的多样性，包括胞体、树突分支和棘，最大化训练模型的泛化能力。这种方法实现了保留重要生物特征的高质量恢复。

接下来，使用可选的轴向恢复方法来减少各向异性并提高棘形态测量的准确性。这一步骤对于传统显微镜技术如共聚焦显微镜非常重要，其中轴向分辨率通常比横向分辨率低2-3倍。对于双光子显微镜，它变得更加关键，由于延长的点扩散函数，横向和轴向分辨率之间的差异可达4-5倍或更多。这些分辨率差异显著影响三维测量的准确性。为解决此类挑战，RESPAN引入了Self-Net。这种两阶段无监督神经网络方法利用显微镜数据固有的各向异性来改善轴向分辨率，而不需要配对的训练数据。通过使用横向图像作为目标，Self-Net可以学习增强轴向分辨率，同时保持对真实生物特征的高保真度。

图像分割

对于图像分割，RESPAN采用三维全分辨率nnU-Net模型，一个用于生物医学图像分割的自配置框架。这种方法根据输入数据属性自动优化网络架构和训练参数，确保跨各种成像条件的鲁棒性能。为确保广泛效用，研究团队创建了一个多样化的训练数据集，包含47个图像体积，其中包含来自该领域常用的多种成像模式的2,489个专家注释的棘：Zeiss Airyscan共聚焦显微镜、Yokogawa W1 spinning disk共聚焦显微镜和Bergamo双光子显微镜。

除了模态特定模型外，研究团队还汇集了来自不同模态的图像，以创建可泛化的高分辨率模型。这涉及通过将Airyscan共聚焦数据集的数据重新采样以匹配spinning disk共聚焦数据集，体素大小为65×65×150 nm，来标准化训练数据。研究团队通过增强扩展数据集以进一步提高模型性能，包括随机旋转、翻转、散粒噪声添加和高斯模糊。这种增强策略与nnU-Net在训练期间生成的动态补丁增强相结合时，改善了模型性能。

RESPAN输出和树突棘形态计量量化

分割后，RESPAN执行树突棘的全面分析，提供每个棘的数值测量和多个验证输出，包括覆盖原始数据与棘检测和距离测量的最大强度投影。测量包括每个棘的体积、其质心位置、所有可用通道的强度测量、形态统计以及距树突轴的距离和距胞体的欧几里得及测地距离。其他测量，如棘颈长度和棘头宽度，按照先前描述进行计算。用户还可以指定约束条件（例如，最小和最大棘体积和距树突的距离）以过滤掉虚假检测。摘要统计包括每个树突和每个图像的棘数量、密度、树突长度和平均棘测量。RESPAN还支持通过Vaa3D的APP2插件以标准SWC格式导出单个神经元或每个图像的树突追踪。对于快速验证和数据探索，所有分割棘的二维和三维阵列以及中间数据（例如，标记的分割、骨架和距离图）可以保存，允许用户验证准确性并进一步优化分割模型。

重要的是，RESPAN还包括一个内置验证模块，能够自动将结果与真实值（GT）注释进行比较。这对于审计RESPAN的性能以及在使用RESAN发布时验证和报告新恢复和分割模型的准确性至关重要。

RESPAN性能的全面验证

研究团队采用了结合像素级和对象级指标的全面验证策略来评估RESAN的性能，遵循基于DL的显微镜分析中的既定实践。对于像素级评估，他们测量了交集超过并集（IoU）和Dice系数（DC），其中A代表RESPAN输出像素，B代表GT像素。这些指标对于评估棘和树突边界的精确描绘特别有价值。对于对象级验证，他们通过采用50%的IoU阈值来量化成功检测到的对象，评估了计数和表征单个棘的准确性。对象级比较生成真阳性（TPs）、假阳性（FPs）和假阴性（FNs），研究团队使用这些来计算两个关键指标：正确检测到的对象比例（精确度=TP/(TP+FP)）和正确检测到的真实对象比例（召回率=TP/(TP+FN)）。棘检测表现出优异的性能，精确度和召回率得分分别为0.988和0.9。最终F1得分为0.94。

针对人类专家注释的RESPAN准确性基准测试

为评估RESPAN在检测树突棘方面的准确性和可靠性，研究团队与具有不同专业知识的多个用户的手动注释进行了全面比较。使用spinning disk共聚焦显微镜，他们首先获取了五个独立的树突段荧光图像。两名在成像和分析树突棘方面有多年经验的专家仔细注释了这些图像，以创建GT共识数据集。然后，他们使用这些GT数据集来评估针对（1）四个具有不同专业水平的独立用户和（2）相同图像的RESPAN输出的棘检测性能。

每个用户在Fiji中分析三维原始荧光图像，使用多点工具在其感知的质量中心标记推定的棘。研究团队编译了每个用户放置的感兴趣区域（ROIs），并将它们叠加到GT共识掩模上。然后，他们使用定制的Python代码来量化每个GT棘在所有用户和图像中检测到的多点ROIs数量，生成棘检测概率图。为确定用户间一致性，他们生成了一个描述用户间 pairwise 检测一致性的相关矩阵，值范围从0（无一致性）到1（完全一致性）。这种分析突出了在棘检测中用户间变异性和主观性的已知挑战，以及手动注释方法中统计偏见的可能性。

然后，研究团队通过这些相同的荧光图像通过RESPAN流程进行自动棘分割。使用定制的Python代码，他们将RESPAN的分割输出叠加到GT共识掩模上，采用0.50的IoU标准来确定正确的棘检测。将RESPAN的性能与用户检测概率进行比较，揭示了两 key 发现。首先，与人类注释者相比，RESPAN显示遗漏检测显著减少，更准确地识别了存在于GT共识掩模中但被多个用户遗漏的棘。其次，RESPAN在仅被用户子集识别的棘检测方面表现出改进的敏感性，表明在具有挑战性的情况下具有卓越的敏感性。此外，与非专家注释者相比，RESPAN显示假阳性减少，因此更精确。

这些结果表明，RESPAN在减轻图像注释中的个体间变异性和人类观察者偏见的同时，优于手动棘识别。此外，自动化方法提供了人类注释不可行的全面形态读数，实现了对树突棘种群更彻底和 unbiased 的分析。

证明图像恢复在棘检测中的重要性

研究团队接下来研究了内容感知恢复如何改善RESPAN在低SNR成像场景中的分割性能，这些场景在活体或体内双光子实验中常见。尽管他们的全局模型1已经在低SNR数据集上提供了合理的分割，但他们的结果表明，在RESPAN处理之前应用CARE恢复模型进一步增强了低SNR数据的棘检测和分割指标。值得注意的是，在这项研究中，他们 intentionally 使用极低SNR图像来反映“最坏情况”成像条件。即使在这些严格条件下，IoU≥0.5的棘检测从0.70-0.75的中位数上升，并且TP棘的比例从0.76增加到0.82。此外，F1得分，它捕获了召回率和精确度，随着IoU阈值变得更加严格，其累积分布显示出显著增加，反映了在分割恢复数据集时准确性的提高。

研究团队还使用Hausdorff距离评估了边界准确性，该距离测量了最极端的不匹配边界点距GT表面的距离。在CARE恢复后，他们观察到显著较低的Hausdorff距离，表明恢复的棘更接近其GT对应物。这种改进对于下游棘体积或表面积测量至关重要，其中单个放置不良的边界点可能会 skew 形态计算。

同样重要的是，可靠恢复低SNR数据的能力对实验设计有实际好处。通过以更短的曝光时间和降低的激光功率捕获图像，用户可以增加通量，同时减轻光漂白和光毒性。反过来，恢复的图像有效地恢复了高SNR特征，确保了准确的量化。因此，他们的工作流程能够以高效和温和的采集参数对棘进行高保真分割，这对于长时间 lapse 系列或大体积采集特别有价值，其中保存样本健康和减少采集时间至关重要。

使用已建立的影响棘密度和形态的表型进行RESPAN的生物学验证

研究团队随后试图验证RESPAN在成年层2/3 PNs中检测来自SRGAP2^+/?小鼠的已确立表型的能力，即增加的棘密度和增加的棘颈长度，但与成年野生型（WT）同窝仔相比，棘体积分布没有显著变化。他们通过慢性颅窗对稀疏标记的层2/3树突进行体内双光子显微镜检查，对来自活WT和SRGAP2^+/?敲除小鼠的树突段进行了盲法基因型/表型分析。对于此分析，神经元通过子宫内电穿孔（IUE）与质粒FLEX-mGreenLantern以及表达Cre重组酶的另一质粒低量一起稀疏标记。

RESPAN分析通过无偏见和盲法方法成功复制了这些已确立的表型。定量分析显示，SRGAP2^+/?突变体显示的棘密度显著高于WT神经元，确认了预期的增加。类似地，SRGAP2^+/?突变体中的棘显示与WT棘相比平均棘长度增加，但WT和SRGAP2^+/?小鼠之间的棘体积没有显著差异，与使用手动分析的先前发现一致。这种验证证明了RESPAN以无偏见方式准确检测和量化树突棘表型的能力，提供了与先前公布证据直接对齐的结果。

为进一步根据已建立的指标验证RESPAN的准确性，他们分析了更大WT PNs种群中的棘形态分布，并将这些结果与来自多个分离的PNs的先前公布的GT数据进行比较，其中所有兴奋性和抑制性棘都被映射和分析。对81,604个棘的分析揭示了特征分布：棘长度遵循正态分布，棘体积显示泊松分布，主要 small 棘和较小的大型棘种群。使用RESPAN，他们分析了来自spinning disk共聚焦显微镜成像的多个WT树突段的10,945个棘，使用0.035和2 μm³的最小和最大棘体积阈值。RESPAN分析导致棘长度和体积的分布与先前公布的分布相当，证明RESPAN一致地复制了棘长度和体积的已确立生物分布模式。

棘跟踪

在多个时间点保持一致的树突棘映射是纵向棘分析中的一个关键挑战，特别是在脑组织可能移动或变形的体内条件下。为解决这一问题，RESPAN提供了一个全面的棘跟踪功能，将三维体积配准、分割和标签匹配集成到单个工作流程中。如所述，他们将此方法应用于通过颅窗在活小鼠中获得的两个独立高分辨率双光子z堆栈。RESPAN首先允许用户对每个堆栈执行刚性或非刚性三维运动校正，确保相应的树突结构 across sessions 准确对齐。

配准后，流程分割树突和棘并跨时间跟踪它们，维护唯一的棘IDs。在 sessions 之间持续存在的棘共享相同的ID， whereas 新形成和消除的棘被 distinctly 标记。这种颜色编码可视化能够快速识别形成、消除和稳定事件。时间评估期间评估的指标被记录。

RESPAN的一个独特优势是将体积对齐和跟踪能力与恢复和分割无缝集成，简化分析并消除对专门编码或计算专业知识的需求。这使研究人员能够处理包含多个成像 sessions 的文件夹及其所需的运动校正方法，并 readily 验证对齐质量。据他们所知，这标志着第一个将三维运动校正、恢复、分割和纵向棘跟踪以集成、半自动化方式结合的基于GUI的流程。通过简化这些先前复杂的工作流程，RESPAN增强了分析体内棘动力学的实际可行性，允许对随时间棘数量和形态的变化进行定量评估。

与其他方法相比的优势和比较

RESPAN解决了棘分析中重现性和效率的关键挑战，在易用性和准确性方面均优于现有工具。为基准测试其性能，他们直接将RESPAN的棘检测结果与DeepD3（一种基于DL的棘检测工具）和Imaris（一种广泛使用的商业三维图像分析解决方案）的结果进行了比较。用于此比较的数据包括使用典型成像参数获取的图像体积，这些参数反映了与蛋白质表达、深度和树突在组织切片内的位置相关的不同图像质量。对于每个软件工具，确定了最佳参数并在所有数据集中保持恒定。在数据集之间微调参数可能会为Imaris和DeepD3产生更好的结果，但这种策略防止了高通量分析并增加了偏见风险。DeepD3和Imaris都表现出比RESPAN更高的假阳性（洋红色）和假阴性（橙色）率。这种降低的准确性反映了这些方法对图像质量变异性的敏感性以及对参数调整的依赖。他们接下来在最小SNRs的情况下基准测试性能，代表极低信号和具有挑战性的成像条件，以及理想SNRs，使用对于典型采集不切实际的高激光功率和具有帧平均随后去卷积的长积分时间获取。这种比较证实，当SNR高且图像之间一致时，使用Imaris的量化可以高度准确，但对于具有混合或低SNRs的数据集，性能显著降低。虽然RESPAN优于DeepD3，但他们观察到DeepD3在准确检测棘和树突体素方面是成功的；然而，尽管在DeepD3界面中扫描了可用的棘检测参数，棘对象的检测仍然较低。

定量指标证实RESPAN实现了卓越的召回率（与DeepD3相比p=0.0144；与Imaris相比p=0.0954）、精确度（与DeepD3相比p=0.0143；与Imaris相比p=0.0177）和F1得分（与DeepD3相比p=0.0047；与Imaris相比p=0.0473）。RESPAN检测到的TP棘百分比也始终保持高于其他工具，反映了跨不同树突形态的更鲁棒性能。这些发现突出了RESPAN的优势，作为一个 fully 自动化、广泛适用的方法，对图像间变异性不那么敏感，并最小化了手动校准或校正的需求。

对于RESPAN与其他方法相比的更广泛概述，请参考。虽然许多常用工作流程结合了多个软件程序或依赖于大量手动干预，但RESPAN将最先进的DL模块用于恢复、分割和验证集成到单个GUI中。这种集成 substantially 减少了技术障碍并促进了重现性，使研究人员能够轻松审核结果并为新数据集重新训练模型。

据他们所知，RESPAN是唯一免费提供的工具，集成了多种最先进的DL方法——内容感知图像恢复、轴向分辨率增强和自配置图像分割。虽然最近的进展显示了特定任务的单个DL方法的力量，例如用于棘检测的DeepD3或用于图像恢复的CARE和Self-Net，但结合这些功能需要 significant 计算专业知识和不同软件工具和环境之间的手动数据处理。RESPAN通过提供一个全面的、易于部署的集成解决方案来解决这一限制，消除了通常与使用多个独立分析工具相关的技术障碍和开销。此外，不是在CPU上执行图像操作，RESPAN利用GPU处理来高效处理并行图像，包括快速生成二维和三维棘阵列。

关键的是，与其他方法不同，RESPAN提供了一个内置工具，用于自动针对GT数据验证分析质量。这解决了一个未满足的需求，因为分割验证通常由编码经验有限的研究人员手动或较不严格地执行。通过整合这种能力，RESPAN可以鼓励对自动化量化采取 rigorous 方法，并增加公布结果的重现性。RESPAN还促进了直接在GUI内训练新的恢复和分割模型，否则这将需要单独的Python环境和编码经验，显著减少了采用这种方法的障碍。

RESPAN显著降低了执行高级图像量化的障碍，对于没有编码专业知识的研究人员。这提出了其他工具所呈现的挑战，这些工具需要结合Python或MATLAB脚本而没有GUI，包括已纳入他们方法的工具。此外，与其他将分析输出限制为树突棘坐标或需要在不同环境中使用多个程序的方法不同，他们的方法在单个GUI环境中提供全面的三维分析。RESPAN还可以通过使用Fiji校正来自所提供模型的初始结果，并利用RESPAN内的工具， readily 适应新的研究问题。

讨论

树突棘分析仍然是理解神经元连接的基石。然而，当前的方法，主要是手动或半自动的，受到交互式注释步骤、图像特定参数、用户依赖变异性和有限通量的限制。在应对这些挑战时，RESPAN引入了一个 fully 集成、DL增强的解决方案，显著拓宽了自动化棘分析的范围和可靠性。

RESPAN的 significant 贡献之一是其集成架构，它将图像恢复、轴向分辨率增强和基于DL的三维分割整合到一个应用程序中。这种设计最小化了手动和传统阈值方法固有的偏见，促进了跨不同成像模态的可重现和直接比较。随着对方法严谨性的日益关注，RESPAN为量化突触可塑性、神经元发育和疾病模型提供了一个简化和鲁棒的框架。

RESPAN还解决了与可访问性相关的 significant 障碍。利用最先进的计算图像分析历史上需要专门的专业知识或昂贵的商业平台。通过将多个软件环境、GPU加速、模型训练和分析验证集成到用户友好的界面中，RESPAN降低了这些障碍并 democratizes 了高级分析工具的使用。这种广泛的可访问性有可能加速从基本突触生理学到神经发育障碍和神经退行性疾病的转化研究领域的发现，其中棘形态和分布的细微变化可能揭示神经元功能的深刻变化。

重要的是要注意，RESPAN提供的形态指标，以及可比方法，受到光显微镜分辨率限制的约束，电子显微镜（EM）是形态学和棘分类精确测量的黄金标准。然而，最近的 expansion microscopy 协议的进步现在使得在传统共聚焦显微镜上实现~20 nm分辨率成为可能，增加了超微结构成像的可访问性。RESPAN采用的方法与此类数据集 readily 兼容。然而，与这些实验相关的 substantially 更大的文件大小可能需要对工作流程进行调整和更长的处理时间。

此外，从任何基于荧光的量化方法解释绝对棘尺寸时，用户应 thus 谨慎行事。令人鼓舞的是，随着 expansion microscopy 等持续进展，将来可能越来越可行地将RESPAN的分析鲁棒性与改进的光学分辨率相结合，进一步缩小光学和基于EM的测量之间的差距。此外，先前的研究已经证明，通过EM和光显微镜获取的神经元形态测量之间的直接定量比较 inherently 不可靠， due to 分辨率和染色方法的基本方法学差异。具体来说，与EM相比，光显微镜 consistently 低估或 misrepresents 关键结构特征，如树突分支复杂性、棘体积和突触形态。

展望未来，RESPAN的架构为未来扩展提供了一个平台。进一步整合额外的分割模型和分析， tailored to 相关的生物特征，如沿树突的线粒体和细胞器分析以及与棘相关的突触前和突触后蛋白质分析，将进一步增强其效用。

开发RESPAN的一个关键目标是 democratize 对高级和复杂计算流程的访问，在一个开源、易于部署的平台中。RESPAN是公开可用的，并且他们致力于维护此状态，以确保所有研究组的公平访问， independent of 财务资源。在开源许可下发布RESPAN还使更广泛的神经科学社区能够 actively 为其持续发展做出贡献， thereby 增强其鲁棒性、适应性和 longevity。他们 anticipate 未来社区驱动的改进将扩展RESPAN对额外成像模态的适用性，并逐步优化计算效率以应对硬件和软件技术的新兴进步。

总之，RESPAN代表了自动化树突棘分析的重大进步，为神经科学社区提供了准确、鲁棒和可访问的量化。通过实现棘形态和分布的 unbiased、高通量测量，RESPAN为更全面和可重现的神经元连接研究铺平了道路。此外，通过共享恢复和分割模型以及作为开源平台的代码，RESPAN促进了协作和迭代开发，使其能够随着研究社区的需求而发展，并确保其持续的相关性和影响。

研究的局限性

虽然RESPAN解决了自动化树突棘量化中的许多挑战，但它确实有局限性。值得注意的是，其性能 heavily 依赖于使用准确标记正在量化的生物特征的数据集训练的DL模型。类似地，当应用于使用与其训练数据中使用的硬件和参数不同的硬件和参数获取的数据集时，图像恢复模型表现不佳。虽然RESPAN包括模型重新训练的工具，但未来的迭代可能受益于更全面的、预训练的模型，这些模型涵盖了更广泛的成像条件。

RESPAN目前仅支持TIFF格式的输入数据，要求在使用前将专有格式转换为TIFF。为解决这一限制，他们提供了一个Fiji宏，以通过OMERO Bio-Formats促进批量转换为TIFF。他们还生成TI格式的输出数据以便于使用，但未来的版本将受益于纳入对OME-Zarr格式的支持以提高可扩展性。

用户应该意识到与应用DL模型到显微镜数据相关的挑战。内容感知恢复和轴向增强模型理想情况下应该在匹配预期应用的生物特征、分辨率和成像模态的数据上进行训练。当模型应用于与其训练集显著不同的数据时，它们可能表现不佳，并通过幻觉特征或降解真实结构引入 artifacts。这在比较具有 substantial 形态差异的实验条件时尤其相关。在这种情况下，训练数据应涵盖预期的全部生物变异范围以确保可靠结果。此外，如最近研究所证明的，当分辨率各向异性比率超过4倍或输入数据具有极低SNRs时，这些模型的性能可能会 degrade。为解决这些限制，RESPAN包括模型验证和重新训练工具，允许用户优化其特定实验条件的性能。

解释RESPAN或任何其他荧光显微镜方法的棘测量时的一个重要考虑是由衍射限制分辨率施加的限制。尽管先进显微镜技术，如Airyscan（如此处所用），接近超分辨率（~100 nm横向分辨率），但它们无法实现通过EM可用的纳米级精度（~10–20 nm），EM仍然是树突棘超微结构量化的黄金标准。由于这种基本分辨率差距，RESPAN获得的棘尺寸与基于EM的测量之间的直接比较不可行。因此，RESPAN不旨在提供EM等效分辨率或绝对纳米级精度。相反，RESPAN旨在在荧光显微镜典型的光学分辨率限制内提供一致、可靠的量化和验证，使得在常规实验设置中能够进行 unbiased、高通量分析。因此，用户在从任何基于荧光的量化方法解释绝对棘尺寸时应 thus 谨慎行事。令人鼓舞的是，随着 expansion microscopy 等持续进展，将来可能越来越可行地将RESPAN的分析鲁棒性与改进的光学分辨率相结合，进一步缩小光学和基于EM的测量之间的差距。此外，先前的研究已经证明，通过EM和光显微镜获取的神经元形态测量之间的直接定量比较 inherently 不可靠， due to 分辨率和染色方法的基本方法学差异。具体来说，与EM相比，光显微镜 consistently 低估或 misrepresents 关键结构特征，如树突分支复杂性、棘体积和突触形态。

另一个重要的考虑因素与运行RESPAN所需的计算资源有关，其中一些根据正在分析的数据大小进行缩放。他们已做出 concerted 努力，通过整合GPU加速和数据分块策略来优化计算效率，以 substantially 减少资源需求。然而，有效使用需要最低硬件规格，主要是NVIDIA GPU，这是DL软件的常见要求，并且仍然 beyond 他们的控制。虽然大多数研究机构通常拥有足以满足RESPAN要求的计算工作站，但确保与所有可用硬件配置的 universal 兼容性 inherently 具有挑战性。通过仔细平衡计算性能和可访问性，他们相信RESPAN有效地减少了高级显微镜分析软件固有的资源相关障碍，尽管某些实际约束 inevitably 仍然存在。