高通量生物打印构建微模式神经上皮组织并模拟TSC2缺陷性脑畸形的新策略

本刊推荐：研究人员针对当前人类多能干细胞（hPSC）神经发育模型在通量和可及性方面的局限，开发了一种基于生物打印的微模式神经上皮组织（scNET）构建方法。该研究通过可编程生物打印技术实现细胞外基质微滴的高精度沉积，结合Matrigel支架促进三维折叠，在6天内成功构建出具有单腔室结构的神经管样组织。利用TSC2基因敲除模型，研究者发现scNET能重现结节性硬化症相关的过度增殖和皮质折叠异常表型，并经雷帕霉素干预验证了表型可逆性。这项研究为高通量药物筛选和神经发育疾病机制研究提供了重要技术平台。

　　

在人类大脑发育研究领域，早期神经管形成阶段因其复杂的时空动态特性而长期缺乏有效的体外模型。传统二维培养缺乏细胞密度控制导致行为变异，而三维类器官则存在异质性和多腔室形成问题。更关键的是，现有微模式化技术如光刻和微流控方法成本高昂、通量低下，严重制约了神经发育疾病机制研究和药物筛选效率。

针对这些技术瓶颈，加拿大西蒙菲莎大学的研究团队在《Cell Reports Methods》发表了创新性研究成果。他们通过可编程挤出式生物打印机，在3分钟内即可打印100个直径精确可控的细胞外基质微滴（最小达500μm），实现了人类多能干细胞的空间限制性生长。结合培养基中添加4% Matrigel提供三维支架，在6天内成功诱导出具有单腔室结构的支架化神经上皮组织（scaffolded neuroepithelial tissues, scNETs）。该技术突破使得研究人员能够大规模生成高度一致的神经发育模型，为疾病机制研究和药物筛选提供了全新平台。

研究采用的关键技术方法包括：1）使用CELLINK BIO x6生物打印机进行可编程微滴打印；2）多能干细胞神经诱导采用双SMAD抑制方案（SB-431542和LDN193189）；3）免疫荧光染色验证细胞极性和分化标志物（PAX6、ZO-1、β-Tubulin III等）；4）EdU标记和Ki-67染色检测细胞增殖；5）Western blot分析mTORC1通路活化状态（pS6水平）；6）使用患者来源的TSC2基因敲除干细胞系进行疾病建模。

Generation of hPSC-derived scNETs by micropatterning on bioprinted matrices

研究人员开发了基于生物打印的标准化scNET生成流程。通过G代码控制打印参数，可精确调控微滴的尺寸（800μm对应 Carnegie stage 13-14期人类前脑神经管直径）、形状和空间排列。细胞接种后经历边缘增厚、多层化过程，24小时内形成环状结构，6天完成神经管样组织自组装。该技术成功率达93.8%（H1 hESC）和88.4%（168 iPSC），显著优于手工操作方式。

scNETs are a physiologically relevant model for early neurodevelopment

组织学分析显示scNETs具有完整的顶基极性特征：顶侧标记物ZO-1和N-cadherin沿腔室分布，PAX6⁺神经祖细胞呈现假复层排列。细胞核分布分析揭示了典型的间期核迁移（IKNM）现象——S期细胞（EdU⁺）偏向基底部，而分裂期细胞（Ki-67⁺）集中在顶表面。更值得注意的是，在第6天已检测到β-Tubulin III⁺和MAP2⁺的早期神经元出现，且神经突朝向基底部延伸，高度模拟体内神经发生过程。

scNETs generated from TSC2-/- hPSCs display hyperproliferation and cortical folding

使用TSC2基因敲除干细胞构建疾病模型时，研究者观察到显著表型变化：虽然早期环状结构形成无异常，但从第2天开始出现边缘扇贝化，最终发展成类似皮质折叠的凸起结构。这种异常形态与初始微滴尺寸相关——500μm组折叠较少而800μm组更显著，表明组织尺寸为异常折叠提供力学基础。细胞水平分析发现TSC2^-/-组细胞尺寸增大、不对称分裂增加，MAP2⁺神经元数量轻微上升，符合TSC疾病中存在的加速神经发生现象。

Rapamycin rescues TSC2-/- phenotypes in scNETs

雷帕霉素干预实验证实表型的mTORC1通路依赖性。20nM处理48小时后，磷酸化S6蛋白（pS6）水平显著降低，组织尺寸和折叠数量明显恢复。高通量筛选显示，雷帕霉素对组织大小的半数抑制浓度（IC₅₀）为0.0974nM，对折叠数量的IC₅₀为0.198nM，证实TSC2^-/-表型对药物高度敏感。值得注意的是，经雷帕霉素处理的突变组组织尺寸仍大于野生型，提示可能存在非经典mTORC1通路参与表型调控。

研究结论表明，这种生物打印驱动的scNET平台不仅能高度模拟早期神经发育过程，更重要的是为皮质发育畸形（MCD）研究提供了可量化、高通量的分析模型。该技术成功再现了结节性硬化症（TSC）的核心病理特征——mTORC1通路过度活化导致的异常增殖和皮质折叠，并通过药物干预验证了平台在筛选治疗策略方面的应用潜力。尽管当前系统仅限于6天内的早期神经发育事件，但该方法为研究神经管缺陷和皮质发育异常疾病的发病机制开辟了新途径，特别是在基因型-表型关联分析和药物敏感性测试方面具有重要价值。

研究的局限性包括目前无法模拟神经发生后期事件（如胶质发生和神经元成熟），且使用的完全敲除模型未能涵盖患者常见的杂合突变类型。未来工作将聚焦于建立患者来源变异体库，并尝试通过脱离培养表面获得游离单腔室类器官，以扩展模型的时间维度和病理模拟能力。