SpliPath：整合罕见剪接变异与RNA-seq数据的新方法增强疾病基因发现

本研究针对罕见剪接变异在疾病关联分析中的挑战，开发了SpliPath工具，整合罕见变异负荷检测、RNA-seq分析和AI预测模型（SpliceAI/Pangolin），发现了肌萎缩侧索硬化症（ALS）中传统方法遗漏的致病基因（如KIF5A分支点变异），为复杂疾病遗传架构解析提供了新范式。

　　

在复杂疾病遗传学研究领域，罕见剪接变异的重要性日益凸显，但如何准确识别其致病性仍是重大挑战。传统负荷检验（Burden Testing, BT）方法面临核心困境：若将良性变异误判为致病变异会稀释真实信号，而过度严格筛选又会漏掉真实致病变异。尤其对于肌萎缩侧索硬化症（ALS）这类遗传率高达60%却缺乏明确孟德尔遗传模式的疾病，仅有10%患者具有家族史，全基因组关联研究（GWAS）的发现效率远低于其他中枢神经系统疾病。

更复杂的是，某些基因中只有特定类型的剪接异常才导致疾病。例如在KIF5A基因中，仅外显子27跳跃与ALS相关，其他剪接变异可能无害。这种特异性使得单纯依赖SpliceAI等序列功能预测模型进行变异筛选的方法效力受限——模型难以区分病理性与非病理性剪接变异。

为解决这一难题，Kevin Kenna团队开发了SpliPath这一创新计算框架。该方法核心思路是通过独立转录组数据集提供的实验证据，将罕见变异按剪接表型进行功能聚类，形成"折叠罕见变异剪接数量性状位点"（collapsed rare variant splicing QTL, crsQTL）。其技术路线整合三大要素：负荷检验的统计框架、传统sQTL分析思路，以及SpliceAI/Pangolin等AI预测模型。通过将WGS（全基因组测序）中发现的罕见变异与RNA-seq（RNA测序）观测到的异常剪接事件精准匹配，实现对致病变异的高特异性聚类。

研究人员在ALS研究中验证了SpliPath的效能。利用纽约基因组中心（NYGC）的294例ALS患者和76例对照的配对WGS-RNA-seq数据，他们首先构建了包含755个异常剪接事件的参考数据库。其中在TBK1和KIF5A基因中发现了已知致病剪接事件：TBK1的共识剪接位点变异（g.64496407G>C）导致外显子16跳跃；KIF5A基因深处内含子区的分支点变异（c.2993-58A>C）引起外显子27跳跃。值得注意的是，KIF5A的分支点变异超出了常规SpliceAI的50bp检测窗口，只有将窗口扩展至500bp才能发现。

随后团队将SpliPath应用于规模更大的Project MinE WGS数据集（6,625例ALS患者 vs 2,472例对照），仅筛选出479个与参考剪接事件匹配的罕见变异。与传统SpliceAI筛选的142,058个变异相比，crsQTL分析方法显著提升了特异性。在KIF5A基因中，crsQTL成功聚合了6个独立变异（8例患者携带，0例对照），而传统BT方法完全遗漏这一信号（OR=0.94, p=0.91）。在12,905例ALS患者和69,718例对照的WXS（全外显子组测序）数据验证中，crsQTL方法检测到9个变异（10例患者 vs 2例对照，OR=20.66, p=8.18×10^-7），显著优于所有对比方法。

研究还发现7个新型候选基因，其中EPG5基因的纯合变异（g.45903935T>TTCAC）导致外显子25延长，在患者组织中显示剂量效应关系。此外，团队尝试将人工细胞模型（TDP-43功能缺失的i3Neurons）中发现的隐匿外显子（Cryptic Exons）作为参考数据集，成功鉴定出CEP290基因的crsQTL（g.88086638A>T），证明了跨模型数据整合的可行性。

关键技术方法包括：1）使用LeafCutterMD从NYGC联盟的多组织RNA-seq数据（额叶皮质、运动皮质、颈髓、腰髓）中识别异常剪接事件；2）采用RegTools进行剪接位点注释；3）应用SpliceAI（窗口扩展至500bp）和Pangolin预测变异剪接效应；4）通过最小基因报告实验验证KIF5A分支点变异功能；5）基于Firth逻辑回归进行病例对照关联分析。

研究结果表明：SpliPath有效解决了"致病/良性剪接变异混合"场景下的基因发现难题，特别适用于仅部分剪接变异致病的基因。与传统BT方法形成互补：当大多数剪接变异均致病时（如NEK1基因），BT方法更有效；而当致病变异占比较低时（如KIF5A），SpliPath显示出独特优势。

讨论部分强调：该方法突破了传统sQTL分析依赖常见变异的限制，首次实现罕见变异的功能聚类。其框架可扩展至其他调控过程，如利用Sei模型预测启动子功能变异（cpQTL），或通过APARENT模型分析多聚腺苷化变异（apQTL）。局限性在于参考转录组数据集的质量和规模直接影响发现效能，且当前剪接预测模型对TDP-43依赖性剪接事件（如UNC13A隐匿外显子）的预测能力仍不足。

这项发表于《Cell Reports Methods》的研究为罕见变异疾病遗传学研究提供了新范式，通过巧妙整合多组学数据和AI预测工具，解决了复杂疾病遗传解析中的关键痛点，为ALS等疾病的精准基因发现和后续靶向治疗开发奠定了方法论基础。