活细胞中转染生物分子的单分子FRET与追踪研究：揭示蛋白质构象动态与细胞定位的新方法

本研究针对活细胞内蛋白质构象动态难以精确测量的难题，开发了FRET-TTB（F?rster共振能量转移-转染生物分子追踪）技术，通过交替激光激发（ALEX）和双通道追踪策略，首次实现了对Hsp90等蛋白在活细胞内的长时程单分子FRET效率测定与运动轨迹追踪，为研究细胞微环境影响蛋白质功能提供了突破性工具。

　　

在生命科学的微观世界里，蛋白质和DNA等生物分子如同精巧的纳米机器，通过不断改变自身构象来执行复杂的生物学功能。这些构象变化不仅受分子自身特性的影响，更与细胞内的拥挤环境、分子间相互作用以及细胞区室化定位密切相关。然而，在活细胞中原位研究生物分子的动态构象变化一直面临巨大挑战——细胞的自发荧光背景干扰、分子的快速扩散运动以及传统技术的时间分辨率限制，使得科学家难以捕捉这些转瞬即逝的分子"舞蹈"。

近年来，单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术虽然在体外研究中取得了显著成功，能够检测小于10纳米的距离变化，但其在活细胞中的应用仍局限于少数膜蛋白。对于像热休克蛋白Hsp90这样重要的胞质蛋白，如何在活细胞环境中研究其构象动态变化，成为领域内亟待突破的科学难题。正是为了攻克这一难题，由德国弗莱堡大学和奥地利维也纳技术大学的研究团队在《Biophysical Journal》上发表了这项创新性研究。

研究人员开发了一套名为FRET-TTB（F?rster共振能量转移-转染生物分子追踪）的系统性方法，主要基于三大技术支柱：首先采用高亮度Lumidyne荧光染料（LD555和LD655）标记靶分子，确保足够的信噪比；其次建立两种转染策略（微注射和链球菌溶血素O介导的转染）将预标记分子导入细胞；最后通过自制的高倾斜薄层光学（HILO）显微镜结合交替激光激发（ALEX）模式，实现双通道（供体和FRET，受体）的单分子追踪与FRET测量，积分时间设置为70毫秒。

研究首先使用定制化末端密封DNA（esDNA）作为标准样本进行方法验证。结果表明，在活细胞中获得的FRET效率（E=0.61）比体外测量值（E=0.80）降低约25%，证明了细胞微环境对分子行为的显著影响。这种差异可能源于细胞内小分子碰撞导致的荧光动态淬灭或蛋白质与DNA相互作用引起的静态淬灭。

活细胞内Hsp90蛋白的smFRET研究

研究人员将重点转向酵母Hsp90二聚体蛋白，在其特定位点（E409C和S601C）进行标记。通过单体交换策略确保大多数二聚体仅在一个单体上带有双标记。实验获得了51条高质量单分子轨迹，最长追踪时间达89秒，smFRET分析时间超过20秒。两个代表性分子分别被追踪62秒和29秒，测得的扩散系数分别为D=(5.6±22)·10^-6μm²/s和D=(1.1±0.47)·10^-4μm²/s，显著低于文献报道的胞质蛋白扩散系数范围（10^-2-10⁰μm²/s），表明这些分子可能被限制在内体或溶酶体等细胞区室内。

体外与细胞内FRET效率分布的比较

通过对比体外（confocal smFRET-PIE）和细胞内（HILO显微镜）测量的FRET效率分布，研究发现两者在主要峰位上高度一致。体外实验检测到四个主要FRET状态：低FRET（E=0.21，15%）、中FRET1（E=0.50，23%）、中FRET2（E=0.73，38%）和高FRET（E=0.92，24%）；而细胞内测量结果显示：低FRET（E=0.21，19%）、中FRET1（E=0.45，42%）、中FRET2（E=0.72，33%）和高FRET（E=0.97，6%）。中FRET1状态（E≈0.4）与Hsp90的开放和闭合构象的理论计算值（E=0.354-0.435）高度吻合，证实了方法的可靠性。其他FRET状态可能来源于单标记或双标记的单体组合。

本研究开发的FRET-TTB技术成功实现了对活细胞内生物分子的长时程单分子FRET测量与运动追踪，突破了传统技术只能研究固定或膜锚定分子的局限。通过结合精确的分子工程、可控的转染策略和先进的光学检测方法，研究人员首次在活细胞中获得了Hsp90等胞质蛋白的构象状态分布，并发现细胞微环境可使FRET效率产生约25%的变化。这项技术不仅为研究蛋白质在天然环境中的构象动态提供了强大工具，更重要的是，它能够同时获取分子的构象状态和空间定位信息，为理解细胞区室化如何调控蛋白质功能开辟了新途径。未来应用这一技术，科学家能够更深入地揭示生物分子在生理环境中的工作机理，推动我们对生命过程分子机制的理解。