基于信号通路优化的培养体系显著提升犬诱导多能干细胞分化潜能

本研究针对犬诱导多能干细胞（ciPSCs）培养体系不成熟、分化能力不足的核心问题，通过建立NANOG报告基因系统筛选关键信号通路，开发出含Activin与WNT抑制剂（IWR1）的AR培养基。该体系显著提升ciPSCs多能性稳定性和心肌定向分化效率，获得具有同步搏动功能的心肌细胞，为犬类疾病模型构建和人类转化医学研究提供关键技术平台。

　　

在生物医学研究领域，伴侣犬自然发生的疾病日益成为极具价值的转化疾病模型。虽然诱导多能干细胞（iPSC）技术已经彻底改变了人类生物医学研究格局，但犬iPSC（ciPSC）技术仍处于发展初期，缺乏稳健的犬特异性iPSC培养基配方和分化方案。现有ciPSC系虽然能满足多能性验证的基本标准，但其向功能细胞的分化能力尚未实现，这严重阻碍了ciPSC在多个领域的应用。先前研究表明，不同ciPSC系在当前培养基中存在异质性，表现为多能性基因表达水平不一致和体内分化潜能不稳定，这表明要么ciPSC的多能性不足以产生功能细胞，要么未知因素影响了其分化。因此，优化培养条件以维持ciPSC作为同质群体，可能改善其分化潜能。

为了解决这一难题，研究人员开展了深入探索。他们首先建立了NANOG报告基因ciPSC系，利用CRISPR-Cas9技术成功将H2B-mClover2构建体敲入犬NANOG启动子位点，并通过免疫荧光染色证实了NANOG与mCLOVER2的共定位表达。通过筛选六种抑制剂（靶向activin/TGF-β、WNT、FGF和视黄酸通路），研究发现FGF信号对ciPSC培养不可或缺，而activin/TGF-β通路对增加ciPSC^high群体细胞数量具有关键作用，同时添加WNT抑制剂可稳定培养并防止分化。最终确定了包含activin和IWR1的AR培养基能显著提高NANOG阳性细胞比例。

研究团队应用了多项关键技术：通过CRISPR-Cas9基因编辑构建NANOG报告基因细胞系；利用流式细胞术进行高通量信号通路筛选；采用RNA测序进行转录组分析和跨物种比较；建立心肌细胞定向分化 protocol；使用免疫荧光染色和细胞功能分析评估分化效果；通过畸胎瘤形成实验验证体内多能性。

研究结果显示，AR培养基培养的ciPSC表现出更加均一的基因表达模式。 hierarchical clustering 和PCA分析显示，AR培养基与对照培养基培养的ciPSC明显分离，差异基因表达分析揭示AR培养基培养的ciPSC具有更同质的基因表达模式。这些ciPSC中谱系标记基因表达下调，而多能性基因表达无显著差异，表明AR培养基可能通过抑制ciPSC分化而非增强其多能性来发挥作用。跨物种比较显示，ciPSC的转录组与小鼠、大鼠和兔子的EpiSCs（上皮干细胞）更为相似，表明其处于primed状态。

在功能验证方面，AR培养基培养的ciPSC成功分化为心肌细胞。这些细胞在分化约7天后开始同步搏动，这是功能心肌细胞的重要标志。定量RT-PCR证实，关键心肌细胞相关基因（NKX2-5、TNNT2、ACTN2、MYH6、MYH7、RYR2和CACNA1C）在ciPSC-CM_AR中显著上调。流式细胞术分析显示，超过30%的分化细胞表达心肌肌钙蛋白T（cTnT），到第10天时这一比例超过半数。免疫荧光染色证实了排列整齐的肌节结构形成，表达了NKX2-5、α-辅肌动蛋白和cTnT。相比之下，对照培养基培养的ciPSC未能产生这些衍生物，突显了AR培养基在心肌细胞分化中的关键作用。

研究人员最终得出结论，AR培养基是一种能够维持ciPSC未分化状态的优化通用培养体系，不受细胞系或基础培养基影响。该培养基使ciPSC表现出独特且同质的基因表达模式，并提高了体内外分化潜能。研究还证实ciPSC处于primed状态（类似于EpiSCs），而非naive状态。AR培养基通过抑制ciPSC分化倾向而非增强多能性来发挥作用，解决了ciPSC自发分化的问题。这项研究为开发犬类疾病模型和人类转化医学应用提供了宝贵资源，具有重要的临床和基础研究价值。

该研究的创新点在于首次建立了犬特异性NANOG报告系统，系统筛选并验证了关键信号通路组合，开发了能够提高分化效率的标准化培养体系，并通过跨物种比较明确了ciPSC的细胞状态定位。这些发现不仅推动了犬干细胞研究领域的发展，也为人类疾病建模和药物筛选提供了新的技术平台和思路。未来研究可以进一步探索AR培养基在更多细胞系和应用场景中的适用性，以及优化WNT抑制剂浓度以平衡细胞增殖和多能性维持的关系。