AGMK1-9T7 GLI1+祖细胞向肿瘤细胞和潜在癌症干细胞演变的分子机制及其在体外模拟人类肿瘤发生中的意义

本文推荐研究人员针对疫苗生产中使用具有致瘤潜能的细胞系所带来的风险问题，开展了AGMK1-9T7细胞系从非致瘤性向致瘤/转移性演变过程中癌症干细胞（CSC）相关基因和miRNA表达的主题研究。研究发现，随着传代，细胞中PODXL和ALDH1A2表达上调，并鉴定出26个与CSC相关的miRNAs，表明该细胞系在传代过程中逐步演变为潜在的癌症干细胞，为人类肿瘤发育机制研究提供了有价值的体外模型。

　　

在疫苗研发和生物制剂生产领域，使用细胞系（如VERO细胞）作为生产基质时，一个长期存在的安全隐忧是这些细胞在经过长期体外传代培养后，可能获得致瘤性和转移能力。这种自发的恶性转化现象不仅对疫苗安全性构成潜在风险，也为研究人类肿瘤的发生和发展提供了一个独特的视角。然而，由于难以获得VERO细胞的早期传代样本，科学家们一直缺乏一个理想的模型来系统追踪细胞从正常状态演变为恶性状态的完整过程，并深入解析其背后的分子驱动机制。为了解决这一难题，研究人员从非洲绿猴肾脏中成功建立了一个新的细胞系——AGMK1-9T7，并对其进行了长达40多代的连续传代培养，旨在模拟细胞自发癌变的整个过程，并探究其与癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）特性的关联。

为了深入探索AGMK1-9T7细胞系的恶性演变过程，研究人员综合运用了多种关键技术。研究首先建立了不同传代次数的细胞库（p13, p23, p33, p43），作为代表不同肿瘤发生阶段的模型。通过肿瘤形成实验，在三种免疫缺陷小鼠（裸鼠、SCID小鼠、CD3 epsilon小鼠）的成体和新生幼体中评估了细胞的致瘤性和转移能力。在分子水平，研究采用蛋白质印迹法（Western Blot） 检测了podocalyxin-like protein 1 (PODXL)的表达动态。利用流式细胞术（Flow Cytometry） 分析了细胞表面标志物CD44、CD24、CD90的表达，并通过ALDEFLUOR试剂盒评估了醛脱氢酶（ALDH1）的活性，这是鉴定癌症干细胞的经典方法。基因表达分析则依赖于RNA测序（RNA-Seq） 和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR），对ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3等基因进行了精确定量。此外，研究还整合了既往已发表的microRNA（miRNA）表达谱数据，系统筛选了与癌症干细胞相关的38种miRNA在该细胞系不同传代中的表达情况。

细胞系特征

研究人员证实，AGMK1-9T7细胞系来源于非洲绿猴肾脏中的GLI1+祖细胞。该细胞系在体外传代过程中，自发地经历了从非永生化、非致瘤性（p1）到永生化、非致瘤性（p30），最终发展为永生化、致瘤且具有转移能力（p40-p43）的完整过程。扩展的动物实验表明，相较于裸鼠，在免疫缺陷程度更严重的SCID小鼠和CD3 epsilon小鼠中，接种p41-p44代次的细胞后，肺部转移灶的发生率显著升高，这强有力地证明了该细胞系的高侵袭性。

CD44、CD24和CD90的表达

流式细胞术分析显示，从p13到p43的所有代次细胞中，CD44的表达率均超过95%。然而，典型的干细胞标志物CD24和CD90在任何代次的细胞中均未检测到表达。这表明AGMK1-9T7细胞可能代表了一种CD44⁺CD24^-CD90^-的独特干细胞亚群。

PODXL的表达

蛋白质印迹分析揭示了一个关键发现：与肿瘤生长、转移和间质-上皮转化（MET）相关的蛋白PODXL，在p33代细胞中才开始被微弱检测到，而到了p43代时，其表达水平已变得非常显著。这表明PODXL的上调与细胞获得致瘤表型的过程密切相关。

不同代次AGMK1-9T7细胞中醛脱氢酶的表达

ALDEFLUOR活性检测实验证明，从p13代开始，AGMK1-9T7细胞就表现出ALDH1酶活性，这是一个广受认可的癌症干细胞标志。相比之下，另一个非洲绿猴肾细胞系AGMK4在低代次（p5, p8）时则未显示此活性，提示ALDH1活性的获得是AGMK1-9T7细胞在特定培养条件下演变的特征。

AGMK1-9T7细胞不同代次中ALDH1基因表达的定量分析

为了更精确地解析ALDH1活性的来源，研究人员通过RT-qPCR对ALDH1A家族基因的mRNA水平进行了量化。结果显示，ALDH1A2基因的表达从p13到p43持续上调，尤其在p43代时表达量急剧升高。而ALDH1A3基因的表达则在p8后逐渐下降至低水平。这表明ALDH1A2基因的上调是驱动ALDH1活性和细胞恶性表型的关键分子事件。

与癌症干细胞相关的miRNA的表达

研究团队系统分析了38个已被报道与癌症干细胞功能相关的miRNA。发现其中有26个在AGMK1-9T7细胞的不同代次（p1至p40）中有表达。这些miRNA参与调控Hedgehog、WNT和NOTCH等关键的干细胞信号通路，它们的动态表达模式与细胞的恶性演进阶段相关联，进一步支持了该细胞系向癌症干细胞状态演变的观点。

与癌症干细胞相关的蛋白编码基因的表达

研究人员重点考察了17个与癌症干细胞功能相关的蛋白编码基因的表达谱。RNA-Seq数据分析表明，在细胞从p13向p45演变的过程中，有5个基因（PODXL, cMYC, QSOX2, KLF16, GBX2）表达上调超过2 log2倍，同时有8个基因（KLF10, LAMTOR2, LAMTOR4, PTEN, DUSP10, KLF4, SOX4, SOX17）表达下调超过2 log2倍。这些基因表达的显著变化主要集中在p34至p40代之间，即细胞获得致瘤性的关键时期，提示这些分子事件共同促成了细胞的最终恶性转化。

本研究通过对AGMK1-9T7细胞系的长期追踪和多组学分析，得出结论：该细胞系在体外传代过程中，自发地经历了一个模拟肿瘤发生的多阶段演变过程，从GLI1+肾脏祖细胞逐步发展为具有致瘤性和转移能力的细胞，并且其分子特征显示出向癌症干细胞状态的演变。这一演变过程由一系列复杂的分子事件驱动，包括染色体拷贝数变异（CNAs）、PODXL和ALDH1A2等关键基因的上调、以及大量癌症干细胞相关miRNA的表达。

该研究的深刻意义在于，AGMK1-9T7细胞系提供了一个前所未有的、可控制的体外模型（in vitro model），用于重现和研究人类肿瘤发生的早期事件和驱动机制。它不仅为评估疫苗生产用细胞系的安全性提供了新的见解和工具，更重要的是，它提出了一个可能性：存在于正常组织中的特定成体祖细胞，在受到某些压力或经历长期培养后，可能被“唤醒”并逆向分化为癌症干细胞，从而成为肿瘤的起源。这一模型为未来发现新的癌症治疗靶点、开发针对癌症干细胞的疗法以及更深入地理解肿瘤异质性和进化打开了新的大门。论文发表在国际期刊《Advances in Cancer Biology - Metastasis》上。