金黄色葡萄球菌菌落生物膜胞外基质成分的动态可视化揭示功能性淀粉样蛋白形成帽状结构

本研究针对金黄色葡萄球菌(S. aureus)生物膜形成机制不明确、缺乏实时监测技术的问题，开发了基于EbbaBiolight 680(Ebba680)光示踪剂的琼脂培养模型，实现了对菌落生物膜生长动力学和胞外基质(ECM)成分时空动态的原位可视化。研究发现功能性淀粉样蛋白fPSMs在生物膜表层形成帽状结构，并通过Δagr突变株验证了agr系统对ECM成分的调控作用。该技术为临床菌株表型筛选和耐药性研究提供了新方法，对优化生物膜相关感染治疗方案具有重要意义。

　　

金黄色葡萄球菌作为重要的人类病原体，其生物膜形成能力是导致临床治疗失败的关键因素。这种细菌通过分泌胞外基质(ECM)成分构建具有复杂三维结构的生物膜群落，能够有效抵抗抗生素作用和宿主免疫防御。然而，传统研究手段难以实现对ECM成分动态形成过程的实时观测，特别是对功能性淀粉样蛋白这类关键组分的时空分布规律缺乏直观的研究方法。

在《Biofilm》期刊发表的最新研究中，科学家们开发了一种创新的琼脂培养模型，通过将光示踪剂EbbaBiolight 680(Ebba680)整合到培养基中，首次实现了对金黄色葡萄球菌菌落生物膜ECM成分的动态可视化监测。该技术利用Ebba680与目标结合后荧光特性发生变化的原理，成功捕捉到ECM成分从合成到组装的整个过程。

研究采用的主要技术方法包括：使用自动化显微镜系统进行长时间序列成像，结合Confocal显微镜进行三维重构分析；通过Δagr突变株验证群体感应系统对ECM的调控作用；利用合成fPSMs肽段进行体外结合实验；升级ColTapp应用程序实现菌落生长与荧光信号的同步量化分析。所有实验菌株包括标准株SH1000、USA300谱系代表株JE2和临床分离株Cl1149。

生长动力学揭示Ebba680荧光信号延迟出现

通过时间序列成像分析发现，在菌落生长初期(4.3±0.3小时)即可检测到亮度信号，而Ebba680荧光信号直到6.0±0.0小时才出现。这种延迟现象表明Ebba680并非直接结合细菌细胞，而是与细菌分泌的ECM成分特异性结合。

Confocal显微镜揭示菌落表面帽状结构形成

高分辨率显微镜观察显示，成熟的菌落生物膜表面形成了一层特殊的帽状结构，Ebba680荧光信号主要分布在该区域。三维重构分析发现红色荧光信号(ECM成分)的最大强度点比绿色荧光信号(细菌细胞)向外偏移0.83±0.11μm，证实ECM成分主要富集在菌落最外层。

单细胞源菌落的胞外成分生产

研究建立了基于单细胞源菌落的分析方法，发现其ECM成分出现时间(10.4±1.2小时)显著晚于宏菌落。但微观结构分析表明两种接种方式形成的生物膜具有相同的ECM分布模式，证明菌落微结构特征与接种方法无关。

fPSMs作为Ebba680结合靶点

通过Δagr突变株实验证实，agr系统控制的PSMs表达是Ebba680的主要结合靶点。体外实验证明Ebba680能够与合成的纤维化PSMα1-4(fPSMs)特异性结合，且结合能力呈现α2>α1>α3>α4的差异。动力学研究表明Ebba680只结合聚集形式的PSMs，这解释了荧光信号延迟出现的原因。

ECM生产追踪为菌落生长动力学量化增加新维度

对USA300谱系菌株JE2和临床分离株Cl1149的比较研究发现，两株菌在ECM成分产量和产生动力学方面存在显著差异。Cl1149的ECM产量达到JE2的两倍，但在生物量达到80%最大值时出现ECM产量下降，提示可能存在群体感应调控或营养限制机制。

该研究首次证实fPSMs在金黄色葡萄球菌生物膜表层形成帽状结构，这种特殊空间分布可能影响生物膜的物理特性和功能。新开发的Ebba680琼脂模型为临床菌株的表型筛选提供了强大工具，能够同时评估菌落生长动力学和ECM生产特性。这种实时监测技术有助于深入理解生物膜形成机制，为开发针对生物膜相关感染的新治疗策略提供了重要技术支撑。研究方法还可扩展到其他革兰氏阳性菌的研究中，具有广泛的推广应用价值。