活细胞中单分子FRET与转染生物分子追踪技术揭示蛋白质动态与定位机制

本研究针对活细胞内蛋白质与DNA动态相互作用及区室化定位难以精准测量的难题，开发了FRET-TTB技术，结合ALEX交替激光激发与HILO显微成像，实现了转染蛋白的单分子追踪与时间分辨FRET分析。团队通过微注射和Streptolysin-O毒素转染策略，发现细胞环境可使FRET效率改变25%，并成功解析Hsp90构象分布。该技术为活细胞内蛋白质状态与定位研究提供了突破性工具。

　　

在生命活动的微观世界里，蛋白质和DNA等生物分子如同精密运作的机器零件，通过不断变换构象状态与相互作用执行生理功能。然而这些动态过程深受细胞内特定区域——即区室化（compartmentalization）环境的影响，就像工人在不同车间会采用不同操作方式一般。传统研究手段却面临三重困境：仪器分辨率不足、细胞自身荧光干扰以及难以持续追踪快速扩散的分子。正因如此，科学家们一直渴望找到一种能在活细胞（in cellula）内同时捕捉分子运动轨迹与构象变化的方法。

近日发表于《Biophysical Journal》的研究论文提出了一项突破性技术——FRET-TTB（F?rster Resonance Energy Transfer-Tracking of Transfected Biomolecules），通过将单分子荧光共振能量转移（FRET）技术与分子追踪相结合，成功实现了对转染蛋白在活细胞内的动态监测。该研究由Abhinaya Anandamurugan、Antonia Eidloth等人在弗莱堡大学物理化学研究所完成，他们采用自下而上的工程化策略，揭示了细胞环境如何显著改变生物分子的构象状态。

研究团队主要运用了四项关键技术：一是基于交替激光激发（ALEX）的双通道（供体与FRET受体）追踪系统，通过高入射角荧光显微（HILO）技术降低背景噪声；二是采用定制化DNA分子作为标准样品进行长期静态FRET验证；三是比较物理方法（微注射）与生物方法（Streptolysin-O毒素介导转染）两种转染策略；四是通过体外（in vitro）与细胞内（in cellula）平行实验量化环境效应。所有实验均在活细胞体系中完成，未使用固定样本。

研究方法与结果

1. FRET-TTB技术平台的构建与验证

研究团队首先设计了染料位置精确已知的定制DNA分子，通过ALEX-HILO系统获取其长期静态FRET轨迹。结果显示该系统能稳定输出高信噪比的FRET效率值，为后续活细胞实验提供了可靠基准。

2. 转染策略的环境效应量化

通过对比微注射与Streptolysin-O毒素转染的效果，发现两种方法均能有效将外源分子导入细胞。更重要的是，当比较相同分子在体外与细胞内的FRET效率时，发现细胞环境会导致效率值产生约25%的偏移，证明细胞内环境显著影响分子构象。

3. Hsp90蛋白的构象动态解析

以热休克蛋白Hsp90为研究对象，团队首次在活细胞内获得其单分子FRET效率分布。数据显示其主要峰位与已知晶体结构及体外实验分布基本吻合，但出现了特有的次要峰群，提示细胞内存在独特调控机制。这些构象差异可能与分子伴侣功能的时空特异性相关。

结论与展望

本研究开发的FRET-TTB技术成功解决了活细胞内单分子追踪与FRET测量协同实施的难题，首次实现了对转染生物分子从构象变化到细胞定位的全维度解析。实验证实细胞微环境会显著改变生物分子的FRET效率（约25%变异），而Hsp90的细胞内构象分布既保留基础特征又展现新态势，暗示区室化调控的复杂性。该技术为研究蛋白质状态转换、分子相互作用网络及其在疾病中的异常机制提供了强大工具，未来可应用于药物靶点筛选、病理模型构建等生物医学领域。

值得注意的是，该方法仍受限于转染效率与荧光标记干扰等挑战，作者建议结合基因编码荧光标签技术进一步优化。正如团队所言：“FRET-TTB开辟了在活细胞中研究转染生物分子蛋白质状态变化及其时间分辨定位的新路径”——这不仅是技术突破，更标志着单分子生物学正式迈入立体化、动态化的细胞环境研究新时代。