综述：CRISPR-Cas9：遗传性血液疾病和血液恶性肿瘤治疗中的突出基因组编辑工具

本综述系统探讨了CRISPR-Cas9技术在遗传性血液病和血液恶性肿瘤治疗中的突破性应用。文章详细解析了其作用机制（包括crRNA/sgRNA导向和Cas9介导的DSBs修复）、递送策略（病毒/非病毒载体），并重点展示了在镰状细胞病（SCD）、β-地中海贫血、范可尼贫血以及CAR-T细胞免疫疗法中的临床前景，同时客观讨论了脱靶效应（OTEs）和免疫原性等当前挑战。

　　

Mechanism of the CRISPR-Cas9 system as a genome editing tool

CRISPR-Cas9基因组编辑技术的作用机制可分为识别、切割和修复三个阶段。在细菌和古菌中，CRISPR-Cas适应性免疫系统利用短的CRISPR RNA（crRNA）来识别特定序列并消除外源遗传物质。这些crRNA被组织在一个紧凑的CRISPR阵列结构中，该结构被转录并加工成单个crRNA。虽然具体加工机制存在显著差异，但所有系统都产生与目标DNA或RNA互补的crRNA。在II型CRISPR-Cas系统中，crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）碱基配对，形成双RNA结构，指导Cas9蛋白到特定的DNA目标位点。如今，crRNA和tracrRNA通常被工程化改造为单个嵌合向导RNA（sgRNA），以简化系统。Cas9-sgRNA复合物扫描DNA，寻找其侧翼为原型间隔区相邻基序（PAM）的互补序列。PAM序列（对于酿脓链球菌Cas9为5′-NGG-3′）是Cas9切割所必需的。一旦结合，Cas9的HNH和RuvC核酸酶结构域分别切割与crRNA互补的链和相反链，产生双链断裂（DSB）。

细胞通过两种主要途径修复DSB：易出错的非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ直接连接断裂末端，通常导致小的插入或缺失（indels），从而破坏基因功能。HDR则利用同源DNA模板进行精确修复，允许引入特定的遗传改变。因此，通过设计合适的sgRNA和供体DNA模板，CRISPR-Cas9能够实现基因敲除、插入或点突变。

CRISPR-Cas9 system delivery formats and methods

选择合适的递送格式对于实现成功、高效和精确的基因编辑至关重要。在临床应用中，安全性也必须考虑。为了使用CRISPR-Cas9平台修改基因组，Cas9蛋白、sgRNA以及在HDR情况下的DNA供体模板必须存在于靶细胞的细胞核中。

CRISPR-Cas9递送格式通常分为三类：质粒DNA、体外转录的mRNA与sgRNA的组合、以及预组装的功能性Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物与sgRNA。每种格式各有优劣。质粒DNA易于生产但可能整合到基因组中并持续表达，增加脱靶风险。mRNA格式避免了整合风险且表达时间短，但可能稳定性较差且具有免疫原性。RNP格式能快速作用且降解快，脱靶效应最低，是目前许多临床应用的首选，尤其是在离体（ex vivo）编辑中。

递送方法可分为病毒和非病毒两大类。病毒载体，如腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV），效率高，但存在插入突变、免疫原性和包装大小限制（特别是对于Cas9）的风险。非病毒方法包括电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）和聚合物纳米颗粒，通常更安全且更容易生产，但编辑效率可能较低。对于造血干细胞（HSCs）等原代细胞的离体编辑，电穿孔是递送RNPs的常用方法。

Expanding the applications of the CRISPR-Cas9 system in hematology

鉴于血液疾病的遗传异质性和造血系统的动态特性，识别用于良性或恶性血液疾病的有效基因仍然是医学科学和疾病管理的重大挑战。为了解决这些局限性，各种基因组编辑工具被开发出来，通过删除、插入或修改目标序列来特异性操纵基因组。

在遗传性血液疾病方面，CRISPR-Cas9在治疗β-血红蛋白病如镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血方面显示出巨大前景。这些疾病是由HBB基因突变引起的。策略包括通过编辑BCL11A增强子来重新激活胎儿血红蛋白（HbF） production，或者直接纠正HBB基因中的突变。临床试验已经证明了这种方法的可行性和有效性。对于范可尼贫血（FA），一种DNA修复障碍疾病，CRISPR-Cas9已被用于在患者来源的HSCs中纠正FANC基因突变，恢复其功能。

在血液恶性肿瘤领域，CRISPR-Cas9彻底改变了癌症免疫治疗，特别是嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法。CRISPR-Cas9被用于敲除T细胞中的内源性T细胞受体（TCR）和HLA基因，以减少移植物抗宿主病（GVHD）风险，同时敲入靶向肿瘤抗原（如CD19）的CAR基因。它还用于敲除免疫检查点基因（如PD-1）以增强抗肿瘤活性。此外，该技术是研究血液癌症分子机制和识别新治疗靶点的强大工具。

The role of base editing and prime editing technologies in hematological disorders

基于核酸酶的基因组编辑方法的一个主要缺点是与诱导DSB相关的细胞毒性。碱基编辑（Base editing）是一种CRISPR-Cas9衍生技术，能够在不需要引入DSB的情况下实现DNA的精确点突变。碱基编辑器通过将催化失活的Cas9（dCas9）或Cas9切口酶（nickase）与脱氨酶融合而成，并通过sgRNA导向目标序列。目前已建立两类主要的碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），介导C•G到T•A的转换；腺嘌呤碱基编辑器（ABEs），介导A•T到G•C的转换。这些编辑器在治疗由点突变引起的血液疾病（如SCD和β-地中海贫血）方面具有巨大潜力。

Prime编辑是另一种更精确的基因组编辑技术，它不需要DSB或双链切口。它使用与逆转录酶（RT）融合的Cas9切口酶和一种扩展的pegRNA（prime editing guide RNA），后者不仅指定目标位点，还编码所需的编辑。Prime编辑器可以直接实现所有12种可能的碱基替换以及小插入和缺失，具有极高的精度和更低的脱靶效应。虽然这些技术仍处于发展的早期阶段，但它们为治疗遗传性血液疾病提供了更安全、更精确的工具。

Off-target effects (OTEs)

关于新兴的CRISPR-Cas技术的应用，在考虑其众多优势的同时，也必须考虑与之相关的局限性和关键挑战。

使用CRISPR-Cas9系统的一个主要担忧是相对较高的脱靶效应（OTEs）频率，这指的是基因组中意外、不希望或不需要的改变的积累。关于减少CRISPR-Cas9系统引起的OTEs的重要性，可以考虑在临床试验中潜在引发致癌突变的风险。OTEs的发生取决于多个因素，包括sgRNA设计、细胞类型、Cas9的浓度和持续时间以及递送方法。

已经开发了多种策略来减轻OTEs。这些包括选择具有高特异性的sgRNA、使用修饰的高保真Cas9变体（如eSpCas9或SpCas9-HF1）、以RNP形式递送以缩短活性持续时间、以及优化递送方法以控制剂量。此外，全基因组测议方法如GUIDE-seq和CIRCLE-seq已被开发用于全面识别和评估潜在的脱靶位点。

Immunogenicity

另一个重要的临床考虑因素是CRISPR-Cas9系统的免疫原性潜力。由于Cas9蛋白来源于细菌（如酿脓链球菌），许多人体内可能存在预先存在的免疫力，或者编辑后的细胞可能引发免疫反应。这种免疫反应可能降低编辑效率，导致编辑细胞被清除，或引起不良炎症事件。策略包括使用来自不同细菌物种的Cas9直系同源物（其中人群免疫力可能较低），或使用人源化/工程化的Cas9变体以减少免疫原性。

Delivery challenges

尽管离体编辑（如对HSCs或T细胞）取得了显著进展，但体内递送CRISPR-Cas9组件以实现体内编辑仍然是一个重大挑战。有效的体内递送需要将编辑器安全、高效地输送到特定的靶组织和细胞，同时避免其他组织的暴露。非病毒递送系统，如LNPs，正在积极研究中，并已显示出一些前景，但还需要进一步的改进。

Conclusions

遗传异质性和造血系统的动态特性增加了传统治疗方法的不足，进一步凸显了发现用于血液疾病（包括遗传性疾病和恶性肿瘤）的新治疗技术的必要性。在此背景下，基因组编辑工具，特别是CRISPR-Cas9，因其简单性、高精度和有效性，在这组疾病的基因治疗中引发了重大革命。

CRISPR-Cas9在治疗遗传性血液疾病（如SCD、β-地中海贫血和FA）以及推进血液恶性肿瘤（特别是CAR-T细胞疗法）的细胞治疗方面展现出非凡的潜力。碱基编辑和Prime编辑等新技术的出现为更安全、更精确的编辑提供了希望。

然而，在CRISPR-Cas9技术能够充分发挥其治疗潜力之前，必须解决脱靶效应、免疫原性和体内递送效率等挑战。持续的研究和技术的改进对于将这些突破性疗法安全地转化为常规临床实践至关重要。未来，随着这些挑战被逐步克服，CRISPR-Cas9有望极大地改变血液疾病的治疗格局，为患者提供新的希望。