基于转录组学多维评估CMV特异性T细胞：优化制备策略以增强免疫治疗潜力

本研究针对CMV感染allo-HSCT后患者缺乏高效、低成本的T细胞疗法问题，通过IFN-γ免疫磁珠分选结合体外扩增策略，成功建立高质量CMV特异性T细胞（CMV-VSTs）制备体系。研究发现使用IL-7/IL-15联合自体饲养细胞可获得转录组特征更优的T细胞产品，为建立区域性CMV-VST库提供了成本效益显著的解决方案，并凸显转录组分析在T细胞治疗评价中的补充价值。

　　

巨细胞病毒（CMV）感染是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后患者面临的最严重并发症之一，可导致高达70%的血清阳性患者发生病毒血症，其中2.92%-17.8%会进展为CMV疾病，显著增加移植相关死亡率和 morbidity。虽然抗病毒药物如更昔洛韦、膦甲酸钠等可用于预防或先发治疗，但存在骨髓抑制、肾毒性等副作用，且无法重建长期免疫保护。因此，过继性输注CMV特异性T细胞（CMV-specific T cells, CMV-VSTs）成为一种极具前景的替代策略，它能够快速重建病毒特异性免疫，且不良反应轻微。然而，当前CMV-VSTs的制备存在诸多挑战：直接分离技术依赖预存的特异性T细胞频率且成本高昂；体外扩增方法虽能量产，但反复抗原刺激可能导致T细胞耗竭；此外，如何以低成本获得高质量细胞产品并建立区域性细胞库仍是全球性难题。

为此，重庆医科大学基础医学院免疫学教研室孙长长、王莹莹团队在《Current Research in Translational Medicine》上发表研究，旨在开发一种通过IFN-γ免疫磁珠分选结合体外扩增的整合策略，以低成本生成高质量CMV-VSTs，并利用多维评估体系（包括表型、功能及转录组分析）优化制备条件。研究人员从22名健康志愿者中采集外周血单核细胞（PBMCs），经CMV pp65肽库（PepTivator CMV_pp65）刺激后，通过IFN-γ分泌检测介导的免疫磁珠分选富集CMV特异性T细胞，随后在四种培养条件下进行扩增：①自体饲养细胞+IL-2、②自体饲养细胞+IL-7/IL-15、③REP饲养细胞（三种异体PBMCs混合）+IL-2、④REP饲养细胞+IL-7/IL-15。关键实验技术包括：IFN-γ ELISpot检测特异性T细胞频率、流式细胞术分析T细胞亚群（TN、TSCM、TCM、TEM、TEFF）和抑制性分子（PD1、LAG3、TIM3）表达、Cell Trace Violet（CTV）增殖实验、混合淋巴细胞反应（MLR）评估同种异体反应性、7-AAD/CTV标记的细胞毒性测定、RNA测序（RNA-seq）及qPCR验证差异表达基因。

3.1 CMV特异性T细胞的生成与表型特征

3.1.1 IFN-γ免疫磁珠分选富集CMV特异性T细胞

ELISpot确认供体CMV特异性免疫反应后，经6小时pp65肽库刺激及MidiMACS分选，获得纯度较高的IFN-γ⁺ T细胞（CD4⁺IFN-γ⁺占比32.31±22.42%，CD8⁺IFN-γ⁺占比50.78±24.75%），细胞活性达87.06%。分选后T细胞以效应记忆T细胞（T_EM）为主（CD4⁺中占77.41%，CD8⁺中占56.86%），早期分化亚群（T_N、T_SCM、T_CM）占比低于5%。

3.1.2 CMV特异性T细胞扩增

所有培养条件均实现有效扩增（扩增指数202-339倍），REP饲养细胞组及IL-7/IL-15组略优于自体饲养细胞组和IL-2组，但无统计学差异（p=0.5846）。

3.1.3 CMV特异性T细胞终产品表型分析

终产品中CD4/CD8比例差异显著（如产品4以CD4⁺为主（80.8%），产品6、8以CD8⁺为主（>80%）），但主要亚群均为T_EM。抑制性分子表达呈现异质性：PD1⁺ T细胞频率0.4%-10.8%，TIM3⁺为4.31%-73%，LAG3⁺在部分产品中异常高表达（最高52.8%）。

3.2 CMV特异性T细胞终产品的功能分析

3.2.1 终产品特异性

细胞内细胞因子染色（ICC）及ELISpot证实终产品具有高特异性：CD4⁺IFN-γ⁺频率21%-89.3%，CD8⁺IFN-γ⁺频率67.2%-97.8%，ELISpot检测到12,501-17,800 SFCs/10⁵细胞，显著高于PBMCs背景。

3.2.2 终产品增殖能力

CTV增殖实验显示，所有终产品在pp65肽库或PHA刺激下均发生显著增殖，且抗原特异性增殖反应优于非特异性刺激组，各组间无显著差异（p=0.5815）。

3.2.3 终产品同种异体反应性

与PBMCs相比，多数CMV-VSTs终产品的同种异体反应性增殖降低，但产品5和7例外，提示可能存在残留同种反应性或交叉反应。

3.2.4 终产品细胞毒性

在效靶比1.25:1时，终产品对pp65脉冲靶细胞的特异性裂解率达57.6±11.5%（p<0.05），且裂解过程中分泌高水平IFN-γ，证实其具有高效抗原特异性杀伤能力。

3.3 CMV特异性T细胞终产品的转录组分析

RNA-seq发现：

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  细胞因子影响：IL-2组上调11个基因（如NRP1、IL-5、IL-13、CXCL8、LIF），这些基因与JAK-STAT通路、阳性趋化及髓系白细胞分化调控相关，提示IL-7/IL-15可能降低T细胞抑制状态。

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  饲养细胞影响：自体饲养细胞组上调135个基因（如SOX4、DGKI、DSG2、DST、PTPN13），富集于肢体/附肢形态发生通路，可能与T细胞极化相关。

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  培养时间影响：14天产品相较于11天产品上调37个基因（如ITGB3、CCL17、CCL22、ECM1、TNFSF14），富集于白细胞迁移通路；相较于21天产品，14天产品上调基因与细胞分裂及氧应答相关，提示其具有更优增殖与适应能力。

  qPCR验证了SOX4在自体饲养细胞组显著高表达（p<0.05），而CCL22、PGF在21天产品中表达升高。

4 讨论与结论

本研究证实了IFN-γ免疫磁珠分选结合体外扩增策略制备CMV-VSTs的可行性，所有终产品均具备高纯度、强增殖、特异性杀伤及低同种异体反应性等治疗优势。尽管表型与功能在各组间无显著差异，但转录组分析揭示IL-7/IL-15联合自体饲养细胞培养14天可获得更优产品（如低NRP1表达、高迁移与氧适应相关基因表达）。该方案为建立区域性、低成本CMV-VST库提供了实践路径，同时凸显转录组分析在超越传统表型/功能评估、深度解析T细胞状态中的价值。未来需进一步验证这些转录组差异的生物学意义，并探索其与体内疗效的相关性。