非结核分枝杆菌蛋白质组学鉴定新策略：简化提取流程提升效率与生物安全性

本文推荐一种优化的非结核分枝杆菌（NTM）蛋白质组提取方法，通过单步甲酸提取/灭活流程，显著缩短MALDI-TOF MS鉴定时间（SGM平均得分1.80，RGM平均2.10），在保证生物安全性的同时维持高鉴定准确性，为临床微生物实验室提供更高效的解决方案。

　　

Abstract

Introduction

非结核分枝杆菌（NTM）的蛋白质组学鉴定技术在近年持续优化。由于不同地域菌株的蛋白质谱存在差异，通用数据库的精准鉴定适用性受到限制。

Methods

我们优化了Bruker Daltonics公司推荐的Myco-Ex和MBT提取方案，该系统为MALDI Biotyper的制造商，其采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术。我们测试了来自西班牙临床微生物与感染病学会（SEIMC）的120株临床分离株、1株环境菌株（加那利分枝杆菌）及7株质控菌株。所有菌株均送至西班牙国家参考中心（卡洛斯三世卫生研究所）分枝杆菌实验室，采用多种分子方法进行鉴定。本蛋白质组提取方法仅包含单步甲酸提取/灭活操作。我们对30株NTM菌株进行生物安全性验证，测试该处理后的存活情况。

Results

88株缓慢生长分枝杆菌（SGM）的得分范围为1.61–2.16（平均1.84），40株快速生长分枝杆菌（RGM）的得分范围为1.66–2.33（平均2.06）。经甲酸处理的菌株培养8周后，临床分离株与对照组均未观察到生长。

Conclusions

我们开发了一种更简便、快速的非结核分枝杆菌蛋白质组鉴定方法（MALDI-TOF），在保持显著得分的同时不妥协生物安全性。

Introduction

非结核分枝杆菌（NTM）是一组多样化的微生物，因多种因素日益受到关注。全球多国报道其发病率上升，临床样本中分离出的NTM数量持续增加。不同地域常见菌种不断变化，且因诊断技术提升，新菌种不断涌现。^1,2

传统分枝杆菌鉴定依赖生化试验，但分子技术已广泛替代之。目前已有多种商业化PCR检测用于临床样本中的NTM检测。³ 通常NTM鉴定需先通过固体或自动化液体培养基培养。常规流程包含三步：DNA提取、生物素标记引物的多重扩增及反向杂交。⁴ 基于蛋白质组学的替代方案中，多数临床实验室近十年已采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行细菌鉴定，成效卓越。质谱技术可分析分枝杆菌部分蛋白质组，涵盖20至20,000 Da范围内的核糖体蛋白。该方法虽适用于普通细菌，但分枝杆菌的特殊结构增加了操作复杂度。结构分析显示，在真细菌中，分枝杆菌核糖体组成和结构与大肠杆菌（Escherichia coli）存在显著差异⁵，因其核糖体蛋白更丰富、体积更大（如r-蛋白）且更复杂。详细结构功能信息由Hentschel等学者概述。⁶ 分枝杆菌鉴定受提取方法、蛋白质谱及数据库物种数量与类型等因素影响。提取方法因分枝杆菌细胞壁复杂性最具争议，为此厂商提出了多种蛋白质释放方案。⁷ 现有方法耗时长，需经历灭活、乙醇提取、锆珠振荡、可选超声步骤及乙腈/甲酸提取。Bruker Daltonics推荐的得分截断值为：＜1.60不可靠鉴定，1.60–1.79为低置信度鉴定，≥1.80为高置信度鉴定。一项多中心研究中，9个欧洲国家的15个实验室使用MALDI-TOF Biotyper鉴定98株NTM临床分离株。5个实验室采用厂商标准Myco-Ex提取法，100%菌株得分≥1.6。⁸ 本研究旨在缩短NTM提取时间，将样本处理简化至普通细菌水平，并通过分子程序（PRA-HSP 65、⁹ Genotype CM或AS Hain）在西班牙国家参考中心（ISC-III）平行验证得分准确性。甲酸提取后，我们进行了存活试验以确保技术安全性。