谷氨酸棒杆菌中新型L-高丝氨酸输出蛋白Cg0701的鉴定与功能表征及其在微生物细胞工厂构建中的应用

本研究针对工业生物基生产中缺乏高效输出蛋白严重限制L-高丝氨酸产量的问题，通过同源性分析在谷氨酸棒杆菌中鉴定出新型输出蛋白Cg0701。研究发现过表达cg0701能显著提升菌株对L-高丝氨酸的耐受性（10.45%）和输出能力（30%），在摇瓶和5L发酵罐中分别实现10.79g/L和48.72g/L的产量，较对照提升19.89%和24.44%。该研究为氨基酸输出系统提供了新见解，对构建高效微生物细胞工厂具有重要指导意义。

　　

在生物制造领域，微生物细胞工厂已成为生产高附加值化学品的重要平台。L-高丝氨酸（L-Homoserine）作为一种非蛋白质氨基酸，不仅是合成L-蛋氨酸和L-苏氨酸的关键前体，更在食品、医药、化妆品和农业等领域展现出广阔应用前景。然而，当前工业生产主要依赖传统化学合成法，存在产率低、成本高、环境污染严重等瓶颈问题。虽然利用大肠杆菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）构建的微生物合成体系取得显著进展，但产物毒性导致的细胞生长抑制和代谢反馈调控等问题，仍是制约产业化的关键因素。

研究表明，高效的输出蛋白系统（exporter protein systems）能够通过维持细胞内氨基酸稳态、减轻反馈抑制和细胞毒性，显著提升目标产物的积累量。然而，目前关于L-高丝氨酸输出蛋白的研究仍十分有限，除大肠杆菌中的RhtA和RhtB以及谷氨酸棒杆菌中的BrnFE外，尚无更多高效输出蛋白被报道。这种知识空白严重限制了L-高丝氨酸微生物合成体系的进一步优化。因此，发掘新型输出蛋白并解析其功能机制，对构建高效微生物细胞工厂具有重大意义。

针对这一科学问题，香港城市大学生物医学工程系的研究团队在《Engineering Microbiology》上发表了最新研究成果。研究人员通过系统的同源性分析和功能验证，成功在谷氨酸棒杆菌中鉴定出一种新型L-高丝氨酸输出蛋白Cg0701，并深入探究了其生理功能与应用潜力。

研究采用的主要技术方法包括：基于BLAST的同源性分析筛选候选基因；利用Gibson组装技术构建重组质粒；通过两步同源重组实现基因敲除和启动子替换；采用高效液相色谱（HPLC）进行产物定量分析；通过摇瓶发酵和5L发酵罐分批补料发酵评估菌株性能。

研究结果方面：

3.1. 通过同源性分析鉴定L-高丝氨酸输出候选蛋白

研究人员以已知的L-高丝氨酸输出蛋白RhtA和RhtB的氨基酸序列为查询序列，在谷氨酸棒杆菌基因组中进行BLAST搜索。结果显示，Cg0701（假设蛋白，内膜转运蛋白）与RhtA的相似性达39.62%，E值低至3.0×10^-37；Cg2941（苏氨酸输出蛋白）与RhtB的相似性为29.76%，E值为3.0×10^-14。这两个蛋白被确定为潜在的L-高丝氨酸输出蛋白候选者。

3.2. 在谷氨酸棒杆菌中对L-高丝氨酸输出候选蛋白进行功能表征

通过耐受性实验发现，在30g/L L-Homoserine条件下，过表达cg0701的菌株CgH-2比对照菌株CgH-1的细胞生长提高了56.23%。平板实验进一步证实，输出蛋白过表达菌株对L-高丝氨酸的耐受性显著增强。

3.3. Cg0701对L-高丝氨酸输出能力的影响

输出实验表明，CgH-2菌株的细胞外L-高丝氨酸浓度比对照提高了29.63%。通过AlphaFold蛋白质结构数据库预测了Cg0701的三维结构，为其转运机制研究提供了结构基础。

3.4. 输出蛋白Cg0701对L-高丝氨酸发酵的影响

摇瓶发酵结果显示，过表达cg0701的菌株CgH-8的L-高丝氨酸产量达到10.52g/L，比对照菌株CgH-7（8.92g/L）提高了约20%。而cg0701缺失菌株CgH-10的产量略有下降。

3.5. cg0701的基因组水平过表达增强L-高丝氨酸生产

研究人员将cg0701的天然启动子替换为强启动子P_sod，构建了菌株CgH-11。该菌株在摇瓶中的L-高丝氨酸产量达到10.79g/L，比对照菌株CgH-6（9.00g/L）提高了19.89%。同时，CgH-11菌株的L-高丝氨酸耐受性提高了10.45%，输出能力提高了28.89%。

3.6. L-高丝氨酸生产的分批补料发酵

在5L发酵罐中，CgH-11菌株的最终生物量达到26.58g/L，L-高丝氨酸产量为48.72g/L，比对照菌株CgH-6（39.15g/L）提高了24.44%。

研究结论与讨论部分指出，本研究通过多方面的证据证实Cg0701是一种新型L-高丝氨酸输出蛋白：首先，cg0701的缺失增加了细胞对L-高丝氨酸的敏感性，而过表达则增强了细胞耐受性；其次，cg0701过表达菌株表现出显著更高的L-高丝氨酸输出活性；最后，在L-高丝氨酸生产菌株中过表达cg0701显著提高了产量，从应用角度证明了其功能相关性。

该研究的重要意义在于丰富了我们对氨基酸输出系统的理解，为工程化高效L-高丝氨酸生产菌株提供了有前景的靶点。输出蛋白系统的优化不仅能够解决产物毒性问题，还能通过维持细胞内稳态来提升整体代谢通量，这对微生物制造平台的进一步发展具有重要指导价值。研究结果不仅适用于L-高丝氨酸的生产，其研究策略和方法也可为其他氨基酸和高附加值化学品的微生物合成提供借鉴。