一种生理相关性血-脑脊液屏障模型及其在神经退行性生物标志物通透性研究中的应用

本研究针对神经退行性疾病生物标志物跨血-脑脊液屏障（BCSFB）转运机制不明确的问题，开发了一种新型大鼠原代脉络丛上皮细胞（CPEC-R）倒置体外模型。该模型通过优化细胞分离培养技术，成功构建具有高TEER值（172±9.5 Ω×cm2）和低Lucifer Yellow通透性（0.95±0.13×10-6 cm/s）的功能性屏障，并证实其可表达LRP-1、LAT-1等关键转运体。研究首次量化了tau蛋白（0.014×10-3 cm/min）与神经丝轻链（NfL）（0.148×10-3 cm/min）的通透性差异，为CNS药物递送和疾病生物标志物转运机制研究提供了重要平台。

　　

中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）受到多重屏障系统的严密保护，其中血-脑脊液屏障（Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier, BCSFB）作为关键界面，通过脉络丛（Choroid Plexus, CP）上皮细胞及其紧密连接（Tight Junctions, TJs）调控物质交换。尽管BCSFB在维持脑内环境稳定和阻止有害物质入侵中发挥核心作用，但其在神经退行性疾病生物标志物转运过程中的作用机制尚未明确。尤其近年来，脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）中tau蛋白和神经丝轻链（Neurofilament Light Chain, NfL）等生物标志物的检测已成为阿尔茨海默病等神经退行性疾病诊断的重要依据，然而这些生物标志物如何从CSF进入外周血液仍缺乏深入研究。现有BCSFB体外模型多采用永生化细胞系，其屏障功能与体内生理状态存在显著差异，且缺乏对关键转运体的完整表达，限制了其在药物开发和疾病机制研究中的应用。

为解决上述问题，Petra Majerova等研究人员在《European Journal of Cell Biology》上发表论文，通过建立一种新型大鼠原代脉络丛上皮细胞（CPEC-R）倒置体外模型，系统评估了屏障的结构功能特性、转运体表达及神经退行性相关蛋白的通透性。该研究不仅为BCSFB研究提供了更可靠的实验平台，还为理解生物标志物的跨屏障转运机制提供了重要数据。

研究采用的主要技术方法包括：从7日龄Sprague Dawley大鼠分离原代脉络丛上皮细胞，通过细胞悬液接种于包被胶原IV和纤连蛋白的Transwell小室建立倒置培养模型；通过跨上皮电阻（TEER）和Lucifer Yellow通透性实验评估屏障完整性；采用免疫细胞化学、Western blot和质谱分析技术检测紧密连接蛋白（ZO-1、claudin-1/2、occludin）及转运体（LRP-1、LAT-1、BCRP1等）的表达与分布；通过ELISA和UHPLC-MS分别定量tau蛋白、NfL及氨基酸的转运；利用Texas Red葡聚糖稀释法测定CSF分泌速率。

3.1. Functional barrier characteristics of BCSFB model formed by CPEC-R

研究通过Pronase酶消化法从大鼠脉络丛中分离上皮细胞，获得高活性（84%±5%）的CPEC-R。细胞接种5-6天后形成融合单层，TEER值达172±9.5 Ω×cm2，且皮质醇和地塞米松处理可显著提升TEER值。Lucifer Yellow通透系数为0.95±0.13×10^-6 cm/s，与TEER值呈负相关（R2=-0.89）。细胞形态学显示立方状上皮特征，肌动蛋白网络结构完整。

3.2. CPEC-R actively secreted CSF

CSF分泌实验表明，上皮细胞在12小时内以线性方式分泌CSF，最大分泌量达136±29.2 μL/cm2，分泌速率为21.8±8.1 μL/cm2/h。

3.3. Inverted in vitro BCSFB barrier developed morphologically dense tight junctions

免疫荧光和Western blot分析证实ZO-1、claudin-1/2、occludin及E-cadherin在细胞间连接处连续分布，表达水平与天然脉络丛组织相近，表明TJ结构高度组织化。

3.4. BCSFB barrier expressed pharmaceutically important receptors and influx/efflux transporters

研究检测到多种药物转运相关蛋白的表达，包括LRP-1、LRP-2、LAT-1（SLC家族）及BCRP1、MRP3（ABC家族）。其中P-gp1定位于顶膜，MRP3位于基底膜。Western blot显示LRP-2、MRP3、BCRP1和LAT-1表达低于天然组织。功能性实验表明LAT-1介导的亮氨酸转运可被苯丙氨酸竞争性抑制。

3.5. CPEC-R actively secrete important proteins

质谱分析鉴定出576种分泌蛋白，随时间推移分泌量逐渐增加。12小时后显著增加的蛋白包括生长因子、细胞基质蛋白、蛋白酶及炎症相关蛋白。基因富集分析显示这些蛋白参与细胞外基质组织、细胞骨架调控及糖胺聚糖结合等生物学过程。

3.6. Permeability study of neurodegeneration-associated proteins

通透性实验显示，tau蛋白与NfL的渗透系数分别为0.014×10^-3 cm/min和0.148×10^-3 cm/min，表明NfL的跨屏障转运能力显著高于tau蛋白。

研究结论表明，该倒置BCSFB模型成功模拟了体内屏障的结构与功能特性，具备表达关键转运体和维持极性分布的能力。其区别于永生化细胞模型的核心优势在于保留了更接近生理状态的药物转运功能和屏障完整性。对tau蛋白和NfL通透性的量化分析，为解释神经退行性疾病生物标志物从CSF至血液的转运差异提供了实验依据。该模型不仅适用于药物渗透性筛选和递送系统开发，还可用于研究病理状态下屏障功能的变化机制，为CNS疾病研究和治疗策略优化提供了重要工具。