短链PAS序列功能化修饰影响H-铁蛋白纳米笼稳定性的机制研究

本研究针对H-铁蛋白纳米笼（HFn）体内半衰期短、清除快的临床瓶颈问题，创新性地探讨了不同长度PASylation修饰对纳米笼稳定性的影响机制。通过构建PAS20-HFn和PAS40-HFn突变体，结合分子动力学模拟与实验验证，首次发现短链PAS20修饰会破坏HFn四聚体界面稳定性，导致纳米笼组装障碍，而长链PAS40则能维持结构完整性。该研究为蛋白质药物递送系统的理性设计提供了关键尺寸阈值参考，对肿瘤靶向纳米载体的开发具有重要指导意义。

　　

在癌症纳米医学蓬勃发展的今天，H-铁蛋白纳米笼（HFn）因其独特的肿瘤靶向性和生物相容性成为药物递送系统的新宠。这种天然存在的蛋白质纳米结构能够通过识别肿瘤细胞过度表达的转铁蛋白受体1（TfR1），像智能导弹一样精准地将抗癌药物送达病灶。然而美好的前景面临现实挑战——天然HFn在血液中停留时间太短，还没来得及充分发挥作用就被机体快速清除，这使得其在临床应用中遭遇了瓶颈。

为了延长HFn的血液循环时间，科学家们尝试了各种表面修饰策略。其中PASylation技术备受关注，它通过在蛋白质表面添加由脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和丝氨酸（Ser）组成的无序结构域，形成类似聚乙二醇（PEG）的保护层。此前研究表明，含有40和75个氨基酸的PAS结构域（PAS40和PAS75）能够显著提高HFn的半衰期。但一个关键科学问题尚未解答：更短的PAS序列是否同样有效？ shorter PAS domains对纳米笼稳定性会产生什么影响？

来自米兰大学的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》发表了创新性研究成果。他们设计了仅含20个氨基酸的短链PAS修饰（PAS20-HFn），并与PAS40-HFn进行系统性比较，通过实验验证与计算模拟相结合的方法，揭示了PASylation修饰长度影响纳米笼组装稳定性的分子机制。

研究采用多种关键技术方法：通过基因工程构建PAS20-HFn和PAS40-HFn重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；使用离子交换色谱（IEC）和尺寸排阻色谱（SEC）进行纯化；借助透射电镜（TEM）观察纳米笼形态；采用动态光散射（DLS）分析流体力学尺寸；利用圆二色谱（CD）解析二级结构；通过AlphaFold3进行蛋白质结构预测；运用粗粒化分子动力学（CG-MD）模拟研究动态行为；并开展基质金属蛋白酶（MMP）切割实验和细胞结合实验验证功能。

3.1. PASylated HFn纳米笼的设计与生产

研究人员成功构建了含有20和40个氨基酸PAS结构域的HFn突变体，并在N末端插入了MMP可切割的PLGLAG序列。AlphaFold3预测显示两种突变体的PAS结构域均能正确暴露在纳米笼表面。

3.2. PAS40-HFn的纯化与表征

PAS40-HFn能够形成稳定的纳米笼结构，SEC洗脱峰出现在12mL处（天然HFn为14mL），TEM显示其保持完整的笼状结构，DLS证实单分散性良好。CD光谱显示α-螺旋含量略有减少，无规卷曲增加，符合PAS结构域的特性。

3.3. PAS20-HFn的纯化与表征

令人惊讶的是，通过IEC纯化的PAS20-HFn无法形成稳定的纳米笼结构，SEC显示其以单体形式存在（洗脱位置晚于天然HFn），TEM未见笼状结构。但CD分析显示其二级结构与天然HFn相似，表明问题不在于蛋白质折叠，而在于四级结构组装。

3.4. 影响PAS20-HFn纳米笼稳定性的因素评估

研究发现PAS20-HFn在细菌内原本能够形成纳米笼，但在IEC纯化过程中解体。进一步实验证实，这种不稳定性并非由洗脱缓冲液的离子强度引起，而是与色谱柱填料的电荷相互作用相关。当使用SEC纯化时，PAS20-HFn能够恢复纳米笼形态。

3.5. PAS20-HFn的分子建模特征

分子模拟揭示了关键机制：PAS20-HFn四聚体在D螺旋末端、D-E转折区和E螺旋起始区域（aa 158-168）表现出异常灵活性，该区域正是形成四聚体界面的关键部位。短链PAS20修饰会干扰相邻亚基C末端E螺旋的正确结合，而长链PAS40则通过自相互作用减少这种干扰。

3.6. PAS20-HFn的功能改变

功能实验显示PAS20-HFn纳米笼的MMP切割效率显著降低（需要120小时才能完全切割），且单体形式根本无法被切割。细胞结合实验表明纳米笼形式的PAS20-HFn仍保留结合能力，但药物装载实验显示其ICG封装量比天然HFn低一个数量级，回收率仅1.08%（天然HFn为31.07%）。

这项研究首次揭示了PASylation修饰对HFn纳米笼稳定性的"双刃剑"效应：虽然PAS修饰能延长血液循环时间，但过短的PAS序列（如PAS20）会破坏纳米笼的关键界面稳定性，导致组装障碍和功能受损。分子模拟表明这种不稳定性源于短链PAS对四聚体界面区域（D-E转折区）动态行为的干扰，而长链PAS40则能通过自相互作用避免这种干扰。

该研究的科学意义在于确立了PASylation修饰的"尺寸阈值"，为蛋白质药物递送系统的理性设计提供了重要参考。研究证明仅考虑延长半衰期是不够的，必须同时评估修饰对纳米结构稳定性的影响，这对未来开发更高效的肿瘤靶向纳米载体具有指导价值。此外，研究采用的实验与计算相结合的方法策略，为纳米生物材料的机制研究提供了范本。

值得注意的是，PAS20-HFn的不稳定性在特定条件下（如IEC纯化）被加剧的现象，提示我们在纳米药物生产过程中需要谨慎选择纯化工艺，避免破坏其高级结构。这种结构-功能关系的深入理解，将推动纳米医学领域向更精准、更可控的方向发展。