大丽轮枝菌甜椒致病性相关基因组位点的鉴定及其机制研究

本研究针对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）宿主特异性机制不明确的问题，通过病原与非病原菌株HR26和GR12的准性重组技术，结合共显性DNA标记分析，首次定位了与甜椒（Capsicum annuum）致病性相关的染色体3短臂上约368 kb的基因组区域。该发现为解析真菌宿主适应性机制及作物抗病育种提供了关键遗传靶点。

　　

在农业生产中，大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的黄萎病是双子叶作物的毁灭性病害，其宿主范围广泛但菌株特异性强，某些菌株可侵染甜椒（Capsicum annuum），而另一些则完全无效。这种宿主特异性的遗传基础长期以来模糊不清，制约了针对性抗病策略的开发。以往研究虽通过准性重组（parasexual recombination）揭示了该真菌在番茄等作物上的致病机制，但甜椒作为经济重要作物，其与大丽轮枝菌的互作机制仍属空白。

为解决这一问题，研究团队选择致病菌株HR26（源自Vdp4，对甜椒致病）和非致病菌株GR12（源自Chr208，对甜椒非致病）进行原生质体融合（protoplast fusion），诱导准性重组。通过抗性筛选（hygromycin B和G418双抗）获得27个重组子（HGR1-HGR27），并经单孢分离和端粒探针Southern杂交验证遗传重组真实性。

研究采用的关键技术包括：

1. 1.

   原生质体融合诱导准性重组；

2. 2.

   基于微卫星标记（如VD12）、AFLP标记和系谱特异性引物（L3/L4）的PCR基因分型；

3. 3.

   甜椒幼苗根部接种致病性评价体系（浓度10⁷ conidia/mL，症状指数0-3分级）；

4. 4.

   统计学分析（Steel检验，P<0.05判定致病性）。

致病性表型分析

重组子接种甜椒后，14株表现致病性（如HGR2、HGR3、HGR4等），13株无致病性（如HGR1、HGR5等）。症状包括叶片黄化萎蔫和维管束褐化，致病菌株再分离率达100%（表1）。值得注意的是，HGR25虽在叶片症状指数未达显著差异，但其维管束病变和病原再分离结果支持其致病性归类。

基因型-表型关联定位

通过27个共显性DNA标记扫描，发现微卫星标记VD12（位于参考菌株JR2染色体3短臂2.992 Mbp处）的PCR扩增模式与致病性完全一致：所有致病重组子均呈现与HR26相同的条带，非致病重组子则与GR12一致（图1，表2）。χ²检验显示VD12匹配度显著偏离1:1预期比（P=5.6×10^?7），而其他标记（如VD10、VD11等）无此关联（表3）。

精细定位致病区域

在VD12侧翼设计新标记（Ch3sa-A至Ch3sa-N），进一步将关键区域缩小至Ch3sa-E与Ch3sa-I之间约368 kb区间（图2）。该区域包含116个预测基因，其中29个被EffectorP预测为胞质或质外体效应蛋白（effector），可能是宿主特异性决定因子。而位于染色体3长臂的番茄致病相关标记Ch3-TV11在本研究中未显示与甜椒致病性关联。

结论与意义

本研究通过准性重组和遗传定位，首次揭示大丽轮枝菌甜椒致病性由染色体3短臂上特定基因组区域控制，且该特性可能为单基因或少数基因主导。不同于番茄致病性的多基因调控模式，甜椒宿主特异性显示出更简单的遗传基础。该发现不仅为作物抗病育种提供了分子靶点（如开发基于VD12的抗性筛选标记），还深化了对真菌宿主适应机制的理解。后续需通过比较基因组和功能验证（如基因敲除或异源表达）明确关键效应基因，最终推动针对黄萎病的精准防控策略构建。论文发表于《Journal of General Plant Pathology》，为植物真菌病害研究提供了范式转移。