驯化选择驱动的WRKY17启动子插入通过lncRNA400-R环-JMJD5表观调控通路增强苹果镉敏感性机制研究

本研究系统揭示了苹果响应镉（Cd）胁迫的分子机制，发现转录因子WRKY17通过lncRNA400-R环-JMJD5表观调控模块激活植物镉抗性基因PCR2表达。驯化过程中WRKY17启动子区3355-bp插入（P-INS）抑制其表达，导致栽培苹果Cd敏感性增加，但延缓叶片衰老，为嫁接栽培提供理论依据。

　　

1 引言

全球农业生态系统正面临严重的土壤镉（Cd）污染问题，农田重金属污染面积已达2.35×10¹²平方米，其中超过90%的Cd污染源于人类工农业活动。Cd污染对果树栽培产生多方面的不利影响：抑制根系发育并减少生物量；破坏锌（Zn）和铁（Fe）等必需元素的吸收和转运，导致营养失衡；诱导活性氧（ROS）积累，造成氧化损伤并损害叶绿体结构，从而降低光合效率。值得注意的是，不同果树品种对Cd胁迫耐受性存在显著差异，如苹果品种"燕富3号"比"王林"表现出更强的Cd耐受性。

现代果树栽培日益采用嫁接技术，将优良品种的高产优质接穗与野生近缘种的砧木相结合，实现生产力与抗逆性的理想结合。研究表明，砧木-接穗组合显著增强植物对Cd胁迫的耐受性，砧木能调控根系对Cd的吸收和积累，并有效阻止Cd向地上部分转运。

WRKY转录因子在植物响应Cd胁迫中发挥层级调控作用，可调控金属转运蛋白基因（包括天然抗性相关巨噬细胞蛋白NRAMP、铁调控转运蛋白IRT1和重金属ATP酶HMA）以及植物螯合素和金属硫蛋白的表达。然而，WRKY转录因子对植物镉抗性（PCR）家族基因的潜在调控仍不清楚。

WRKY转录因子通过与长链非编码RNA（lncRNA）的协调代表一种重要的调控模式。在拟南芥中，lncRNA APOLO招募WRKY42到RHD6的启动子区域激活其表达。但WRKY-lncRNA在Cd应激反应中的串扰机制尚未探索。

LncRNA通过包括R环介导的表观遗传重编程机制调控基因表达。R环是由RNA-DNA杂交体和单链DNA形成的三链结构，在表观修饰中发挥调控作用。水稻全基因组研究表明，20%的H3K4me3位点与R环相关。在拟南芥中，lncRNA APOLO通过促进R环形成调控表观修饰。值得注意的是，水稻lncRNA L16通过特异性去除ZIP16位点的抑制性H3K27me3标记，激活其表达并增强Cd耐受性，在Cd应激适应中起关键作用。

表观修饰在植物响应Cd胁迫中起关键调控作用，但在苹果中的具体机制尚不清楚。目前研究表明，在水稻中，OsZIP1（锌调控转运蛋白，铁调控转运蛋白样蛋白）位点的H3K9me2去甲基化促进Cd外排，而DNA甲基化和H3K27me2沉积的减少激活OsHMA表达。然而，苹果Cd应激响应的表观调控网络尚未阐明。

2 结果

2.1 WRKY17启动子的自然结构变异影响苹果Cd敏感性

通过10个野生和栽培苹果品种的Cd耐受性测试发现，野生苹果（包括山荆子、新疆野苹果、森林苹果、楸子和湖北海棠）在50μM CdCl₂处理30天后表现出高Cd耐受性，叶片生长健康；而栽培苹果品种如"蜜脆"、"嘎拉"、"寒富"、"M9"和"富士"对Cd敏感，显示大量叶片坏死。叶片坏死率的统计分析支持这些表型。

对三个野生（山荆子、新疆野苹果和森林苹果）和五个栽培苹果（"蜜脆"、"嘎拉"、"寒富"、"M9"和"富士"）的基因组分析揭示了大量结构变异（SVs），包括插入和缺失（InDels），主要分布在启动子和基因间区域。为鉴定Cd相关SVs，筛选了野生苹果特有和栽培苹果特有的SVs，并注释这些SVs的相关基因。野生苹果特有的SVs富集于根系发育、磷代谢和细胞过程调控等与生长发育相关的基因本体（GO）术语；而栽培苹果特有的SVs富集于过渡金属离子转运、激素水平调控和DNA结合转录因子活性等GO术语。

通过山荆子50μM CdCl₂处理0、6、12和24小时的RNA-seq分析显示基因表达随时间显著变化。将RNA-seq数据与启动子区域含有SVs的基因列表和含有Cd相关SVs的基因整合，鉴定出25个候选基因，包括3个转录因子基因和多个蛋白酶基因。从中选择三个转录因子进行进一步研究：MD12G1181000（WRKY17）、MD15G1283700（HSF4）和MD06G1051800（ERF1）。WRKY17在先前研究中被确定为在苹果响应干旱、盐和低氮等非生物胁迫中起关键作用。

进一步分析WRKY17启动子的序列变异，在WRKY17启动子537bp处（相对于转录起始位点）鉴定到一个3355-bp插入，命名为P-INS变体。PCR检测在所有五个栽培苹果品种中均一致检测到该插入，而在野生苹果种质中完全缺失。鉴于栽培苹果是从野生祖先驯化而来，推测P-INS可能代表控制苹果Cd应激响应的关键驯化选择遗传决定因子。

通过双荧光素酶（LUC）测定评估该插入对WRKY17表达的影响，使用带有（Pro-P-INS-WRKY17::LUC）或不带（Pro-WRKY17::LUC）插入的WRKY17启动子。与62-SK+Pro-P-INS-WRKY17::LUC相比，62-SK+Pro-WRKY17::LUC共浸润本氏烟叶片显著增加荧光素酶活性，表明该插入降低MdWRKY17表达。Cd胁迫（50μM CdCl₂）下的表达分析进一步证实了这一发现：野生苹果植株显示WRKY17诱导表达与增强的Cd耐受性相关，而栽培苹果表现抑制表达与降低的耐受性相关。另外两个Cd响应转录因子（HSF4和ERF1）的表达分析表明，在Cd胁迫下，HSF4和ERF1在野生和栽培苹果中均显著诱导，进一步证实WRKY17启动子区域的P-INS插入是野生和栽培苹果Cd耐受性差异的关键遗传变异。

3355-bp插入含有与光（ACE、AE-box）、胁迫（GATA-motif、LTR）和赤霉素信号（GA-motif、GARE-motif、P-box）相关的顺式元件。50μM GA₃处理实验显示WRKY17在野生和栽培苹果中的诱导模式相似，无基因型依赖性差异，表明插入片段中的GA响应元件可能不是导致差异表达模式的主要功能组件。

为阐明P-INS变体对Cd应激响应的功能影响，构建了由带有（Pro-P-INS-WRKY17::WRKY17-1301）或不带（Pro-WRKY17::WRKY17-1301）P-INS变体的WRKY17启动子驱动的表达载体，并通过发根农杆菌介导的转化稳定转化Cd敏感"GL-3"苹果植株。50μM CdCl₂处理后，表达Pro-P-INS-WRKY17::WRKY17-1301或空载体（EV）的植株显示严重叶片坏死，而表达Pro-WRKY17::WRKY17-1301的植株坏死显著减少。这些结果表明天然P-INS变体减弱WRKY17表达，从而增加苹果Cd敏感性。

2.2 WRKY17在苹果Cd应激响应中的正向作用

为进一步研究WRKY17在苹果Cd胁迫下的作用，用50μM CdCl₂处理过表达MdWRKY17的转基因苹果植株（MdWRKY17-OE）、MdWRKY17 RNA干扰（RNAi）植株（MdWRKY17-RNAi）和野生型（WT）"GL-3"植株。土壤中CdCl₂处理60天后，MdWRKY17-RNAi植株叶片出现明显黄斑，而MdWRKY17-OE植株叶片保持绿色。与表型变化一致，MdWRKY17-OE植株在Cd胁迫下光合速率和叶绿素含量显著增加，而MdWRKY17-RNAi植株光合效率和叶绿素积累显著降低。直接受Cd胁迫影响的根系显示，与WT相比，MdWRKY17-RNAi植株侧根数量显著减少，MdWRKY17-OE植株显著增加。这一表型也反映在根干重上。

为研究转基因和WT苹果植株CdCl₂处理60天后的Cd含量，进行Cd染色和Cd含量测量。MdWRKY17-OE植株比WT具有更少的红棕色复合物和更低的Cd含量；而MdWRKY17-RNAi植株在叶片和根中显示更多的红棕色复合物和显著更高的Cd含量。这些发现提供有力证据表明WRKY17正向调控苹果植株对Cd胁迫的响应，增强Cd耐受性。

2.3 LncRNA400作为WRKY17在苹果Cd耐受性中的关键下游效应子

为探索MdWRKY17在Cd耐受性中的分子机制，在MdWRKY17-OE植株中进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。该分析未鉴定到与Cd胁迫相关的直接靶标，表明MdWRKY17通过间接机制调控Cd应激响应。ChIP-seq进一步鉴定出三个长链非编码RNA（lncRNA）：MD02G1041400-MdlncRNA400、MD05G1025900-MdlncRNA900和MD10G1159500-MdlncRNA500，可能参与Cd应激响应。MdWRKY17-OE和WT苹果植株的RNA测序（RNA-seq）证实MdlncRNA400在MdWRKY17-OE植株中显著上调，与ChIP-seq结果一致；而MdlncRNA500和MdlncRNA900表达在这些植株中无显著变化。鉴于其显著上调，选择MdlncRNA400进行进一步研究。

RNA-seq还鉴定出六个金属离子转运蛋白基因的上调，包括五个重金属相关结构域（HMA）基因和一个植物镉抗性2（PCR2）基因。MdWRKY17可能通过调控Cd吸收、 sequestration、解毒和/或外排途径间接调控这些基因介导Cd应激响应。

为验证MdWRKY17在调控MdlncRNA400表达中的直接作用，进行转基因苹果植株的RT-qPCR。MdlncRNA400在MdWRKY17-OE植株中显著上调，在MdWRKY17-RNAi植株中显著下调。为探索MdWRKY17与MdlncRNA400启动子的结合相互作用，进行ChIP-qPCR测定。检测到MdWRKY17与MdlncRNA400启动子的结合在MdWRKY17-OE植株中比WT显著更高。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）在体外验证了这一特异性结合。然后进行双荧光素酶（LUC）报告基因测定以确认这一转录调控。将Pro35S::MdWRKY17与ProMdlncRNA400::LUC共浸润本氏烟叶片显著增加LUC活性 compared to EV+ProMdlncRNA400::LUC对照。这些结果共同证明MdlncRNA400是MdWRKY17的直接下游靶标。

通过分析50μM CdCl₂胁迫下的表达研究lncRNA400在Cd响应中的作用。与WRKY17类似，lncRNA400在Cd耐受的野生苹果中上调，在Cd敏感的栽培品种中下调，表明它们在Cd耐受性中的协调调控。产生过表达MdlncRNA400的转基因"GL-3"苹果植株（MdlncRNA400-OE）以及RNAi敲低MdlncRNA400表达的植株（MdlncRNA400-RNAi）。土壤中50μM CdCl₂处理60天后，MdlncRNA400-OE植株比WT对Cd胁迫表现出更大的耐受性，而MdlncRNA400-RNAi植株对Cd胁迫表现出更高的敏感性。生理和生化分析进一步证实这些发现：MdlncRNA400-OE植株比对照显著增加光合速率和更高叶绿素含量；还显示增强的根生长，表现为更大的根干重；Cd染色显示转基因植株根组织中Cd积累减少，而定量分析确认根和叶中Cd浓度降低。相反，MdlncRNA400-RNAi植株在所有测量参数中显示完全相反的表型。这些数据表明MdlncRNA400作为苹果Cd耐受性的关键正调控因子。

2.4 LncRNA400通过与PCR2启动子形成R环增强苹果Cd耐受性

为研究lncRNA400如何发挥功能，进行核-质分离实验，发现MdlncRNA400主要定位于核。核定位的lncRNA可能通过顺式或反式作用机制调控靶基因表达。顺式作用lncRNA在其转录位点附近功能，通常表现低表达水平，需要敲低实验进行功能验证；而反式作用lncRNA可调控远端基因组位点，其功能可通过过表达或敲低方法验证。

基于这些机制区别，对MdlncRNA400-RNAi转基因植株进行RNA-seq分析以研究其调控作用。六个HIPP（重金属转运/解毒超家族蛋白）基因、一个HMA2（重金属ATP酶2）基因和一个PCR2基因的表达在MdlncRNA400-RNAi植株中受抑制。这些基因中，只有MdPCR2在MdlncRNA400-OE植株中上调，在MdlncRNA400-RNAi植株中下调。值得注意的是，MdPCR2也在MdWRKY17-OE的RNA-seq数据中鉴定出，因其在这些植株中上调。为阐明调控网络，分析Cd胁迫下的PCR2表达。定量分析显示PCR2与WRKY17和lncRNA400协调表达，在Cd胁迫后Cd耐受的野生苹果中显著上调，在Cd敏感品种中显著下调。这种共调控模式，加上WRKY17直接激活lncRNA400转录的实验证据以及两个基因功能上贡献于Cd耐受性，强有力地将PCR2确立为WRKY17-lncRNA400调控模块控制Cd应激响应的关键下游组件。

产生过表达MdPCR2的转基因苹果愈伤组织（MdPCR2-OE）或RNAi介导敲低MdPCR2的愈伤组织（MdPCR2-RNAi）。50μM CdCl₂处理20天后，转基因MdPCR2-RNAi愈伤组织生长显著抑制，表明比WT对Cd胁迫更高敏感性；而MdPCR2-OE愈伤组织表现增强的耐受性和比WT愈伤组织更好的生长。WT愈伤组织重0.10g/FW，而MdPCR2-RNAi愈伤组织鲜重仅0.04g/FW，MdPCR2-OE愈伤组织鲜重0.18g/FW。这些结果表明PCR2在WRKY17-lncRNA400-MdPCR2调控通路中作为正调控因子增强苹果Cd耐受性。

为研究lncRNA400如何促进PCR2表达，进行染色质RNA纯化定量PCR（ChIRP-qPCR）分析。MdlncRNA400结合到MdPCR2启动子的P1和P2片段，这些是G富集区域。使用QGRS Mapper分析该区域鉴定出多个G-4 motif。在植物基因组中，GC-或AT富集区域以及G-4 motif易于形成R环结构。使用QmRLFS-finder分析显示MdPCR2启动子的P1和P2区域可形成R环结构。进一步细分P1和P2区域并进行DNA免疫沉淀定量PCR（DRIP-qPCR）分析。确实，MdlncRNA400在MdPCR2启动子的P1和P2位点形成RNase H敏感