人红细胞源酶鸡尾酒的大规模制备与生物物理特性分析：为生物医学应用提供新型抗氧化与pH调节酶制剂

本研究开发了一种从人红细胞裂解液中大规模提取高纯度酶鸡尾酒的新方法，通过乙醇-氯仿沉淀技术有效分离血红蛋白（Hb），成功富集碳酸酐酶（CA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧还蛋白（Prx）等关键酶类。该制备工艺具有可扩展性，获得的酶制剂在保持高活性的同时显著降低Hb污染，为治疗氧化应激相关疾病（如缺血再灌注损伤、血红蛋白基氧载体开发）提供了新型生物治疗策略。

　　

1 引言

红细胞（RBCs）在气体运输中发挥核心作用，其功能主要依赖于细胞内血红蛋白（Hb）和碳酸酐酶（CA）的协同作用。由于持续暴露于高氧环境，红细胞面临活性氧（ROS）生成的挑战，其自身通过超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧还蛋白（Prx）和谷胱甘肽 peroxidase（GPx）等抗氧化酶系统维持氧化还原平衡。这些酶的缺陷与多种临床异常相关，包括溶血性贫血和糖尿病并发症，因此开发大规模提取技术具有重要生物医学价值。

2 材料与方法

研究采用过期人红细胞单元，通过切向流过滤（TFF）技术进行细胞裂解和澄清处理。关键创新在于使用乙醇-氯仿溶液（67.5:32.5）进行选择性沉淀，通过离心分离血红蛋白沉淀与酶富集上清液。采用10 kDa中空纤维过滤器进行纯化浓缩，并通过SDS-PAGE、SEC-HPLC、MALDI-TOF和LC-MS/MS等多重生物物理技术进行表征。酶活性检测使用商业试剂盒测定CAT、SOD和CA的活性单位。

3 结果

3.1 红细胞酶分析

大规模批次生产（90g/批）显示平均酶回收率达44.4%±8.2%，每批获得0.85±0.16g酶制剂。血红蛋白去除率超过98%，最终产物中Hb污染仅占0.2%-0.5%。

3.2 SDS-PAGE分析

非还原和还原条件电泳证实酶鸡尾酒主要包含CA（30 kDa）、CAT（60 kDa单体）、SOD（17 kDa单体）和Prx-2（22 kDa单体/44 kDa二聚体）。密度计量分析显示CA占96.1%±2.16%，CAT、SOD和Prx分别占1.93%、0.73%和0.27%。

3.3 MALDI-TOF分析

质谱检测到CA三种亚型（28,749 m/z、30,202 m/z、31,716 m/z），CAT单体（59,695 m/z）以及SOD单体（15,690 m/z）和二聚体（33,747 m/z）。残留Hb亚型信号显著低于原料。

3.4 胰蛋白酶消化LC-MS/MS分析

emPAI定量表明酶鸡尾酒中CA-1和CA-2分别占总蛋白55%-65%和15%-25%，SOD和CAT各占2%-3%。检测到微量Prx、GPx-1、BLVRB、CYB5R3和Trx等抗氧化蛋白。

3.5 SEC-HPLC分析

尺寸排阻色谱显示酶鸡尾酒存在两个主要峰：32 kDa（CA）和200 kDa（CAT四聚体），而原料血红蛋白峰（64.5 kDa）基本消失。

3.6 纯化酶分析

通过离子交换色谱成功分离单一酶组分：SOD在75 mM NaCl洗脱，CAT在100-150 mM NaCl洗脱，CA通过疏水相互作用色谱在铵硫酸梯度洗脱获得。

3.7 酶活性分析

纯化后酶活性显著提升：CAT达13,972±3764 U/g（较原料提高130倍），CA达1116±54 U/g（提高50倍），SOD达2,530,110±590,706 U/g（提高76倍）。酶鸡尾酒阶段SOD活性已实现35倍富集。

4 讨论

该方法成功实现了红细胞酶的大规模制备，克服了传统锌沉淀法可能引起酶结构改变、丙酮沉淀法Hb去除不彻底的局限。乙醇-氯仿处理通过将Hb驱入有机相实现选择性分离，结合高浓度磷酸盐缓冲液维持酶构象稳定性。虽然回收率低于小规模方法（70%-100%），但绝对产量显著提升，满足制备需求。

酶鸡尾酒中CA的高占比特性使其特别适用于需要pH调节的应用场景，如血红蛋白基氧载体（HBOCs）开发。结合SOD和CAT的抗氧化功能，可构建多功能治疗系统（PolyHb-CAT-SOD-CA），用于出血性休克和缺血再灌注损伤治疗。此外，该制剂可作为纳米酶开发基础，模拟天然酶的级联抗氧化功能。

5 结论

本研究建立的可扩展制备平台能够生产高纯度、低Hb污染的红细胞酶鸡尾酒，富含CA和抗氧化酶系统。色谱纯化是获得高活性CAT和CA的关键步骤，而SOD在中间阶段已实现有效富集。该技术为氧化应激相关疾病的治疗提供了新型酶制剂平台，具有重要的转化医学价值。