靶向SLC1A4介导的丝氨酸代谢——Skullcapflavone II通过抑制L-丝氨酸摄取诱导线粒体损伤抑制胃癌进展

本研究揭示Skullcapflavone II（SkII）通过直接靶向丝氨酸转运蛋白SLC1A4，抑制L-丝氨酸摄取，破坏胃癌细胞内氧化还原平衡（GSSG/GSH升高），诱导线粒体损伤和能量代谢障碍，最终抑制肿瘤增殖和转移。体内实验表明，联合丝氨酸/甘氨酸缺乏饮食可显著增强SkII的抗肿瘤效果，为胃癌靶向治疗提供了新策略。

　　

1 引言

胃癌（GC）是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管手术、化疗和靶向治疗有所进展，晚期胃癌患者的5年生存率仍低于30%，亟需开发新的治疗策略。代谢重编程是癌症进展的关键特征，癌细胞通过调整代谢途径满足生物合成需求并维持氧化还原平衡。L-丝氨酸作为一种非必需氨基酸，在支持癌细胞代谢、肿瘤生长和治疗抵抗中发挥重要作用。细胞内L-丝氨酸可通过从头合成途径或细胞转运获得，随后用于甘氨酸、半胱氨酸的合成以及抗氧化防御机制。

丝氨酸转运蛋白SLC家族成员（包括SLC1A4、SLC1A5、SLC6A14和SLC12A4）共同介导细胞L-丝氨酸摄取。在不同癌症类型中，主导丝氨酸摄取的转运蛋白存在差异：SLC1A5在乳腺癌中起主要作用，SLC6A14在结直肠癌中占主导，而SLC1A4被确定为白血病和血脑屏障中主要的丝氨酸转运蛋白。然而，在胃癌中主导L-丝氨酸摄取的转运蛋白尚未明确。

Skullcapflavone II（SkII）是一种从黄芩中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、肝保护和神经保护等多种药理活性。此外，SkII还能调节破骨细胞的分化、存活和功能。许多来自黄芩的黄酮类化合物，如黄芩素、汉黄芩素和黄芩苷，已通过调节细胞代谢、调控ROS清除酶活性以及抑制癌细胞增殖和侵袭能力，显示出抗癌效果。SkII还能显著抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。然而，关于SkII在胃癌中的作用和机制尚缺乏系统研究。

2 结果

2.1 SkII抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移并促进其凋亡

为评估SkII对胃癌细胞的细胞毒性和抑制作用，用SkII处理人正常胃上皮细胞（GES-1）和胃癌细胞系（HGC27和AGS）。细胞毒性试验表明，随着时间和浓度的增加，SkII对胃癌细胞系HGC27和AGS的细胞毒性显著高于胃上皮细胞系GES-1。SkII处理HGC27和AGS细胞后，EdU阳性细胞比例呈剂量依赖性减少，表明SkII抑制胃癌细胞增殖，这一结果通过集落形成试验进一步证实。

划痕和Transwell试验评估了SkII对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。随着SkII浓度的增加，伤口愈合面积和通过小室的细胞数量均减少。此外，SkII处理下调了与上皮间质转化（EMT）通路相关的间质标志物（如N-钙黏蛋白、MMP2和波形蛋白）的表达，同时上调了上皮标志物E-钙黏蛋白的表达。

SkII还以剂量依赖性方式诱导HGC27和AGS细胞凋亡。Western blot结果显示，促凋亡蛋白（cleaved PARP和Bax）表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。这些发现表明，SkII有效抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移，并促进凋亡，为SkII作为胃癌潜在治疗药物提供了基础。

2.2 转录组学和代谢组学分析揭示SkII重编程丝氨酸代谢

为探究SkII抑制胃癌的潜在机制，对用DMSO（对照组）或16 μM SkII（SkII组）处理48小时的HGC27细胞进行RNA测序（RNA-seq）。主成分分析（PCA）显示，两组之间存在明显分离。KEGG富集分析显示，SkII处理后发生显著变化的顶级通路中，包括与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢相关的通路。在这些基因中，L-丝氨酸转运蛋白SLC1A4的表达在SkII处理后显著降低，提示SkII可能在氨基酸转运水平干扰丝氨酸代谢。

代谢组学分析进一步证实了转录组学的发现。SkII显著降低了L-丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的丰度，同时增加了氧化型谷胱甘肽（GSSG）的水平，而对3-磷酸丝氨酸（3-PS）或还原型谷胱甘肽（GSH）水平无显著影响。这些代谢物之间的相互作用代表了关键的代谢交叉点：L-丝氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶转化为甘氨酸，甘氨酸进入一碳代谢途径，驱动半胱氨酸的从头合成，而半胱氨酸是谷胱甘肽生物合成的关键组分。

2.3 SkII通过抑制L-丝氨酸摄取影响胃癌细胞丝氨酸代谢通量

细胞L-丝氨酸的可用性受两个因素调节：细胞外L-丝氨酸的摄取和从头合成途径。同位素示踪实验使用¹³C₆-D-葡萄糖和¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸作为示踪剂，追踪丝氨酸代谢的贡献途径。

¹³C₆-D-葡萄糖示踪显示，SkII处理显著增加了¹³C₃-3-PS的丰度，但对¹³C₃-L-丝氨酸水平无显著影响，表明SkII并不通过影响从头合成途径改变细胞内L-丝氨酸水平。

为测试SkII是否通过抑制L-丝氨酸摄取发挥作用，使用¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸示踪。结果显示，SkII处理后细胞内¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸和¹⁵N,¹³C₂-甘氨酸水平显著降低，下游代谢物¹⁵N,¹³C₂-GSH和¹⁵N,¹³C₂-GSSG的变化趋势与代谢组学结果一致。SkII处理后，源自¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸的m+4同位素标记部分在细胞内L-丝氨酸中受到显著抑制，而GSH和GSSG中的m+3同位素标记部分显著增加，提示SkII可能通过影响转运蛋白或抑制底物摄取途径，减少外源性标记底物的细胞摄取。

此外，SkII处理导致SLC1A4蛋白和mRNA水平呈剂量依赖性降低，并显著加速SLC1A4降解，而对磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH）无显著影响。这些结果共同表明，SkII通过抑制L-丝氨酸摄取而非从头合成重编程丝氨酸代谢。

2.4 SkII直接靶向SLC1A4导致线粒体损伤

SLC蛋白通常具有广泛的底物特异性，许多转运蛋白能够摄取L-丝氨酸。为功能验证SLC1A4，进行基因敲低和过表达实验。使用¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸示踪发现，SLC1A4敲低使细胞内¹⁵N,¹³C₃-L-丝氨酸水平降低50%以上，而SLC1A4过表达显著增加L-丝氨酸摄取，表明SLC1A4在胃癌细胞L-丝氨酸转运中起主要作用。

SLC1A4敲低显著降低细胞活力，且SkII处理进一步加剧了这一效应。相反，SLC1A4过表达增加细胞活力并减弱了SkII的抑制作用。为研究对L-丝氨酸摄取的依赖性，使用PHGDH抑制剂NCT-503抑制细胞内L-丝氨酸合成，迫使细胞主要依赖细胞外L-丝氨酸摄取。在这种丝氨酸剥夺条件下，SkII的抗肿瘤疗效显著增强。

为确定SkII是否直接调控SLC1A4，进行肽中心局部稳定性分析（PELSA），显示SkII改变SLC1A4的蛋白酶敏感性，提示直接相互作用。表面等离子共振（SPR）测定使用纯化的SLC1A4蛋白证实，SkII以102 μM的KD值与SLC1A4结合，表明具有中等亲和力。药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）分析进一步验证了这一相互作用：SkII孵育后，SLC1A4蛋白水平高于DMSO对照组，表明SkII结合稳定了SLC1A4。细胞热位移分析（CETSA）显示，SLC1A4随温度升高而降解，而SkII保护SLC1A4免受热变性。这些结果共同支持SkII与SLC1A4之间的直接相互作用。

为阐明SkII结合如何影响SLC1A4的L-丝氨酸转运功能，进行分子动力学模拟（MD）。SLC1A4与L-丝氨酸的结合自由能为-19.88 kcal mol^-1，而SLC1A4-SkII结合表现出更强的亲和力（-39.26 kcal mol^-1）。在SkII存在下，SLC1A4-L-丝氨酸的结合自由能增加至-14.463 kcal mol^-1，表明相互作用减弱。结构分析显示，SkII诱导SLC1A4形成更松弛的构象，这为SkII变构抑制SLC1A4介导的L-丝氨酸转运提供了机制见解。

SkII直接结合SLC1A4，抑制L-丝氨酸摄取，最终导致GSSG/GSH比率增加，提示SkII可能影响细胞内氧化还原平衡。流式细胞术检测细胞内ROS水平，结果显示SkII显著增加HGC27和AGS细胞中的ROS水平。使用JC-1荧光探针评估胃癌细胞线粒体膜电位（MMP）的变化。SkII处理后，红色荧光聚集体显著减少，表明处理细胞MMP显著破坏。ROS的过度积累和MMP消散共同导致线粒体功能障碍，最终损害细胞能量代谢。

透射电子显微镜（TEM）分析显示，SkII处理的胃癌细胞出现线粒体形态损伤，特征为线粒体肿胀和嵴密度降低。同时，线粒体压力测试结果显示，SkII处理的胃癌细胞基础耗氧率（OCR）较低，基础呼吸、ATP生产和最大呼吸受到显著抑制。实时ATP速率测定显示，SkII处理的胃癌细胞总ATP生产率低于对照组，SkII显著降低线粒体ATP和糖酵解ATP生产率。这些结果表明，SkII主要通过诱导氧化应激和线粒体损伤抑制细胞能量供应。

2.5 SkII在体内表现出抗肿瘤疗效并抑制瘤内丝氨酸代谢

为评估SkII是否对体内胃癌肿瘤生长有治疗作用，将HGC27细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中建立皮下肿瘤模型。与对照治疗相比，SkII治疗显著抑制皮下肿瘤生长，肿瘤体积和重量明显减少。此外，小鼠对SkII的给药剂量耐受良好，H&E染色显示SkII治疗后荷瘤小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺或肾组织未出现损伤。

为研究SkII介导的肿瘤生长抑制机制，进行免疫组织化学（IHC）染色评估SkII对凋亡和增殖的影响。TUNEL和KI67染色表明，SkII通过诱导凋亡和抑制细胞增殖抑制肿瘤生长。此外，SLC1A4在肿瘤组织中高表达，SkII以剂量依赖性方式降低SLC1A4蛋白水平。与细胞中的代谢组学结果一致，SkII治疗显著降低肿瘤组织中的L-丝氨酸、甘氨酸和GSH水平，同时增加GSSG水平。这些发现表明，SkII显著降低SLC1A4水平，诱导凋亡，抑制增殖，并抑制丝氨酸代谢。

2.6 饮食限制丝氨酸和甘氨酸增强SkII的肿瘤抑制效果

体外实验表明，SkII通过直接靶向L-丝氨酸转运蛋白SLC1A4抑制L-丝氨酸摄取，从而影响胃癌细胞丝氨酸代谢。因此，给原位荷瘤小鼠喂食正常饮食或丝氨酸和甘氨酸缺乏（SG-）饮食（其中丝氨酸和甘氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶相互转化），以评估SkII治疗的效果。活体成像结果表明，SG-饮食抑制肿瘤生长，而SkII治疗增强了这种效果。通过监测体重变化评估毒性。与对照组相比，单独SG-饮食或SkII与SG-饮食联合均未引起体重显著变化。

转移是癌症的关键问题，尤其在胃癌中，转移常见于肝脏和腹膜。研究SG-饮食或SkII与SG-饮食联合对肝、腹膜和脾转移的影响。结果显示，SG-饮食和SkII治疗均有效抑制脾和肝的转移性肿瘤结节，SkII与SG-饮食联合进一步增强了这种效果。SG-饮食显著抑制瘤内L-丝氨酸和甘氨酸水平，同时加剧氧化应激。值得注意的是，SkII与SG-饮食共同给药通过协同调节代谢和氧化途径，增强了这些抗肿瘤效果。此外，SLC1A4表达也相应降低。

2.7 SLC1A4在胃癌组织中上调并被SkII抑制

为验证SLC1A4蛋白在胃癌中的过表达，使用组织微阵列的IHC染色检查其表达，并分析其与临床病理特征的相关性。SLC1A4在胃癌组织样本中的表达显著高于癌旁组织样本。此外，SLC1A4的表达水平与肿瘤大小和TNM分期密切相关，表明SLC1A4可能促进了胃癌的进展。高SLC1A4表达水平还与胃癌患者较短的总生存期（OS）相关。

胃癌类器官保留了相应原发肿瘤中观察到的组织学特征。因此，用SkII处理胃癌类器官以模拟SKII对原发胃癌的潜在效果。验证胃癌类器官是否保留亲本肿瘤的表型特征。

综上所述，本研究系统阐明了SkII通过直接靶向SLC1A4抑制L-丝氨酸摄取，破坏胃癌细胞内氧化还原平衡，诱导线粒体损伤和能量代谢障碍，最终抑制肿瘤增殖和转移的分子机制。体内外实验证实了SkII的抗肿瘤效果，并发现联合丝氨酸/甘氨酸缺乏饮食可显著增强其疗效。这些发现不仅揭示了SLC1A4在胃癌中的重要作用，也为胃癌的靶向治疗提供了新的策略和潜在候选药物。