基于标记代谢物的多组学分析揭示甘蓝型油菜千粒重调控新基因位点及BnaA03.TGA6的负调控机制

本综述系统阐述了利用代谢组学数据结合多组学分析（mGWAS、mTWAS、eGWAS）鉴定甘蓝型油菜千粒重（TSW）关键调控因子的创新研究。研究发现137个与TSW显著相关的标记代谢物，并通过构建代谢物-基因-QTL三元网络揭示了BnaA03.TGA6转录因子通过激活泛素途径基因BnaA07.DA2表达负调控种子大小的新机制。该研究为作物产量性状的代谢物标记辅助育种提供了重要理论依据。

　　

代谢谱分析鉴定甘蓝型油菜TSW的137个标记代谢物

通过对388个甘蓝型油菜自交系成熟种子的代谢组学分析，共定量了2172种代谢物。研究发现46个持续负相关和91个持续正相关的TSW标记代谢物，这些代谢物在两年实验中表现出良好的重复性。代谢物分类显示包括14种类黄酮、10种氨基酸衍生物、4种苯丙烷类代谢物和109种未知代谢物。TSW标记代谢物的平均遗传力值为0.67，高于所有检测代谢物的平均水平。

多组学分析揭示调控TSW的潜在QTL

mGWAS分析检测到133个TSW标记代谢物的1154个显著相关变异，利用100kb的连锁不平衡阈值，这些显著相关位点被分类为734个代谢物QTL（mQTL）。这些mQTL在A03、C03、C05、C06、C07和C09染色体上呈现明显的热点分布。

基于40天开花后（DAF）种子转录组数据的mTWAS分析发现了9077个与TSW标记代谢物显著相关的基因。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）将转录本聚类为139个模块，其中19个模块与TSW显著相关。sienna3模块与TSW的相关性最强，该模块在细胞命运决定和种皮发育方面显著富集。

eGWAS分析揭示了与9077个基因显著相关的59121个变异，这些变异被分类为5225个表达QTL（eQTL）。eQTL热点分析显示在A02、A03、A05、A09、C01、C02、C03、C06、C07和C09染色体上存在与超过100个基因相关的eQTL，表明这些区域可能存在转录调控因子。

种子发育相关基因BnaC09.DDM1与TSW显著相关

研究发现BnaC09.DDM1（BnaC09g07810D）与TSW相关代谢物显著相关。在mQTL4855内的单倍型分析显示，具有单倍型C的自交系在种子中具有较高的S21-2486含量。mTWAS分析表明BnaC09.DDM1与S21-2486含量显著相关，其表达水平与S21-2486显著相关。eGWAS结果显示BnaC09.DDM1的表达水平与1个顺式eQTL和7个反式eQTL显著相关。

三元关系网络促进对TSW和SOC的理解

通过整合mGWAS和转录组分析结果，构建了包含731个QTL、3321个基因和133个TSW标记代谢物的三元关系网络（基因-QTL-代谢物）。基于TSW、标记代谢物、mQTL、eQTL和mTWAS的综合结果，筛选出30个影响甘蓝型油菜TSW的种子大小相关候选基因。

通过比较SOC和TSW的标记代谢物，发现了21个SOC和TSW共有的标记代谢物，包括11种类黄酮代谢物、1种苯丙烷类代谢物和9种未知代谢物。其中11种类黄酮代谢物与SOC和TSW均呈负相关，与31个mQTL相关。三个未知代谢物S21_S-0678、S21_S-4234和wm0031与SOC负相关，与TSW正相关，与34个mQTL相关。

BnaA03.TGA6是负调控甘蓝型油菜TSW的关键转录因子基因

研究发现位于A03染色体上的mQTL555热点与11个代谢物相关，其中10个代谢物与TSW显著正相关，1个代谢物与TSW显著负相关。三个有趣的标记代谢物S21-0694、S21-1527和S21-4360与TSW正相关。

mTWAS结果显示BnaA03.TGA6与三个代谢物相关：S21-4360、S21-4031和S21-0694。eGWAS分析显示BnaA03.TGA6的表达水平与1个顺式eQTL和2个反式eQTL相关。WGCNA分析将BnaA03.TGA6分配到turquoise模块。

通过创建BnaTGA6六突变体，发现两个独立的BnaTGA6六突变体系CR1和CR2的TSW分别比野生型高27.6%和29.9%。代谢组学分析显示突变体中S21-0694、S21-1527和S21-4360的水平显著升高。转录组分析发现3715个差异表达基因，其中6个与种子大小调控相关的基因表达水平发生显著改变。

BnaA03.TGA6通过抑制BnaA07.DA2调控TSW

通过全基因组预测BnaA03.TGA6结合 motif，发现了1313个潜在的BnaA03.TGA6互作靶标。在6个TSW相关差异表达基因中，只有BnaA07.DA2在其启动子区域含有预测的BnaA03.TGA6结合 motif。

利用甘蓝型油菜叶片原生质体进行CUT&Tag实验，发现在BnaA07.DA2启动子区域P1处存在显著峰。CUT&Tag-qPCR方法证实BnaA03.TGA6在Bna07.DA2 P1启动子区域显著富集。

瞬时双荧光素酶实验表明，当与BnaA03.TGA6效应器共转化时，由BnaA07.DA2启动子驱动的荧光素酶表达显著上调，表明BnaA03.TGA6可能激活BnaA07.DA2转录。电泳迁移率变动分析（EMSA）使用纯化的His-BnaA03.TGA6蛋白和合成启动子片段证实了与BnaA07.DA2启动子P1区域的直接结合。

实验方法

研究基于包含505个材料的群体中选择了388个材料，在武汉（2017年、2018年）种植。使用WSeen SC-G TSW分析系统获取TSW表型数据，每个材料6个重复。转基因甘蓝型油菜材料安排在华中农业大学转基因作物田间。

变异调用通过读段的meta分析进行，使用甘蓝型油菜基因组作为参考基因组。使用PLINK收集次要等位基因频率>5%的变异。使用FaST-LMM软件进行mGWAS和eGWAS分析。

利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统创建TGA6突变体材料。通过金门组装将PCR片段转化到pKSE401载体中。通过杂交不同的突变体系创建BnaTGA6六突变体。

代谢物提取使用含0.1mg/L阿昔洛韦（内标）的70%甲醇进行 homogenize，在4°C下提取10小时后，通过0.22μm有机膜过滤器过滤后进行LC-MS分析。

双荧光素酶报告实验使用pGreenII0800-LUC载体和pM999-YFP载体，在拟南芥原生质体中进行。RNA-seq分析使用RNAprep Pure Plant Kit提取总RNA，使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit制备文库。

原生质体分离使用Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit进行。将BnaA03.TGA6全长编码序列克隆到pM999-GFP表达载体中，通过PEG介导的转化引入甘蓝型油菜原生质体。

RT-qPCR使用SYBR Green化学方法在CFX Connect Real-Time PCR系统上进行。基因表达水平以ACTIN7（BnaA06G0089200WE）为内参进行标准化。

EMSA实验将BnaA03.TGA6全长编码序列克隆到pET15D载体中，表达His-BnaA03.TGA6融合蛋白。启动子片段用FAM在5'端标记，与纯化的His-BnaA03.TGA6蛋白在EMSA/Gel-shift结合缓冲液中孵育。