靶向髓系细胞的肽树枝状大分子-脂质纳米载体：癌症免疫治疗的新平台

本刊推荐：本研究开发了一种新型肽树枝状大分子-脂质（PDL）纳米载体（MCTN），可系统性给药并特异性靶向髓系细胞（MCs），同时规避肝脏脱靶。该平台作为癌症疫苗载体，利用全长抗原诱导强烈T细胞免疫反应；通过递送组成性活性干扰素调节因子5（IRF5）mRNA，重塑肿瘤微环境（TME），耗竭免疫抑制细胞并增强CD8+ T细胞浸润，显著抑制实体瘤生长，为癌症免疫治疗提供了创新策略。

　　

1 引言

髓系细胞（MCs）包括树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞类型，执行组织修复、先天免疫反应以及通过抗原呈递和细胞因子释放启动适应性免疫反应等关键功能。MCs的失调和功能障碍导致多种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病。利用MCs向适应性免疫系统呈递抗原的能力，基于mRNA递送至抗原呈递细胞（APCs）的癌症疫苗已被开发出来，用于治疗多种实体瘤，包括黑色素瘤、胰腺癌和非小细胞肺癌。一个例子是“现货型”疫苗BNT116，这是一种RNA-脂质复合物（LPX）疫苗，通过静脉给药靶向脾脏APCs，目前正处于治疗晚期非小细胞肺癌的2期试验阶段。免疫肿瘤疗法也正在开发中，以直接靶向肿瘤微环境（TME）内的MCs。在TME内，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）通过支持血管生成和肿瘤细胞运动，同时创建高度免疫抑制、免疫学“冷”的微环境来协助肿瘤扩张。这种免疫抑制环境阻碍了肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在肿瘤内的进入和功能。激活TAMs可以逆转这种表型，导致肿瘤生长减少。尽管MCs显示出作为核酸基础癌症治疗靶点的潜力，但使用传统基因递送平台（如临床批准的病毒载体和脂质纳米颗粒（LNPs））在体内转染和选择性靶向它们仍然很困难。

先前，我们证明了我们的肽树枝状大分子-脂质（PDL）纳米载体平台在转染效率和有利的毒性特征方面可以胜过最先进的LPX。在此，我们开发并验证了一种自组装的基于PDL的纳米载体，用于选择性MC靶向（MCTN）。我们确定MCTN有效转染小鼠和人类巨噬细胞，并且系统性给药将核酸递送至脾脏，同时与经典LNPs不同，避免了肝脏靶向。与剂量匹配的LPX相比，MCTN在系统性给药后对脾脏的有效载荷递送更优。因此，我们通过证明体内诱导抗原特异性T细胞反应和抑制肿瘤模型中的肿瘤生长，验证了我们的MCTN平台作为一种新型癌症疫苗递送方式。最后，我们证明了MCTN的全身给药可用于将有效载荷直接递送至TME，选择性靶向MCs而非其他细胞类型。利用编码组成性活性干扰素调节因子5（IRF5）的封装mRNA，我们证明了MCTN的免疫调节能力，通过耗竭免疫抑制巨噬细胞同时增强CD8⁺ T细胞浸润，使TME在免疫学上变“热”。与TME的这些改变同时，我们观察到肿瘤生长受到抑制，突出了使用MCTN靶向TME的治疗潜力。

2 结果

2.1 MCTN有效转染巨噬细胞

我们通过流式细胞术分析用封装eGFP mRNA的MCTN（MCTN-eGFP）转染过夜的原代小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和人类单核细胞源性巨噬细胞（huMDM）来评估MCTN的转染效率。MCTN-eGFP制剂平均大小为154 nm，平均多分散指数（PDI）为0.090，平均mRNA封装效率高达98.2%。MCTN-eGFP平均转染了58.4%的小鼠BMDMs和77.5%的huMDM。

巨噬细胞对MCTN的摄取主要通过吞噬作用和巨胞饮作用发生。同样，使用同一组抑制剂，吞噬作用和巨胞饮作用先前已被发现是MCs摄取LPX制剂的关键介质。MCTN对巨噬细胞的靶向可能归因于MCTN颗粒中的许多精氨酸残基，这些残基可以刺激巨胞饮作用和吞噬作用。巨胞饮作用和吞噬作用也是MCs的区分功能，它们参与MCTN摄取提供了MC相对于其他细胞类型选择性的潜在机制。内体酸化先前已被确定为LNP封装的mRNA内体逃逸的关键机制。我们的结果表明，使用V-ATP酶抑制剂巴佛洛霉素A1，内体酸化在MCTN介导的mRNA递送中具有类似作用。

检查小鼠巨噬细胞（J774细胞）MCTN转染效率的剂量匹配实验表明，MCTN转染巨噬细胞的效率远高于基于Moderna COVID-19疫苗的LNPs和LPX系统。我们的结果表明，MCTN与其他领先的纳米载体系统相比具有优异的巨噬细胞转染效率，并且可能也优于甘露糖化纳米颗粒和F4/80抗体缀合的LNPs，后者先前在体外对巨噬细胞的转染效率分别约为30%和40%。

2.2 MCTN将有效载荷递送至脾脏并避免肝脏靶向

我们通过生物发光分析检查了用系统性给药的封装编码荧光素酶的mRNA的MCTN（MCTN-荧光素酶）处理的动物的体内生物分布情况。与对照组相比，MCTN-荧光素酶组脾脏的体内荧光素酶信号显著更高，而肝脏中的信号则检测不到。从用MCTN-荧光素酶处理的小鼠分离的肝脏和脾脏的离体生物发光分析同样发现脾脏中有强烈的荧光素酶信号，相反，肝脏中的荧光素酶信号最小。因此，MCTN克服了经典LNPs的一个主要缺点，即优先靶向肝脏，使得能够通过静脉给药将治疗性转基因递送至脾脏，而不会对肝脏产生脱靶影响。

使用LPX递送平台对脾脏APCs进行系统性mRNA递送比局部递送引发更强的免疫反应，介导肿瘤排斥并能够以低剂量治疗。事实上，LPX疫苗autogene cevumeran在临床试验中以低剂量（如25 μg）系统性给药，而肌肉给药的mRNA-4157（基于LNP）在患者中的给药剂量较高，为1 mg。当我们将MCTN对荧光素酶mRNA的脾脏递送与剂量匹配的LPX进行比较时，发现MCTN的脾脏荧光素酶信号平均高出343倍。使用流式细胞术分析，我们还检查了体内被MCTN靶向的脾脏细胞类型，通过施用Alexa Fluor 488标记的由MCTN封装的mRNA。MCTN优先靶向单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，而不是淋巴细胞。

2.3 系统性MCTN是一种有效的癌症疫苗递送方式

鉴于MCTN有效地将mRNA递送至脾脏中的MCs，这是抗原呈递的关键部位，我们检查了MCTN作为疫苗递送系统的潜力。我们使用了鸡蛋白卵清蛋白（OVA），这是一种常规用于评估疫苗递送平台功效的抗原，包括细胞、肽、DNA、病毒和其他基于mRNA的平台。我们使用了由MCTN封装的未修饰编码全长OVA的mRNA（MCTN-OVA）。

我们首先通过IFN-γ ELISpot assays检查了MCTN-OVA诱导体内T细胞免疫反应的能力。从用MCTN-OVA疫苗接种的小鼠分离的脾细胞产生了强烈且显著更高的斑点计数，与载体组的OVA反应相比。用无关蛋白刺激脾细胞不会诱导MCTN-OVA疫苗接种组与载体组相比斑点数量的显著差异。这些结果表明，我们的基于MCTN的疫苗可以显著诱导抗原特异性T细胞反应，并作为mRNA疫苗递送平台。

当在表达OVA的B16F10肿瘤模型中检查我们疫苗平台的治疗效果时，我们观察到MCTN-OVA疫苗接种有效地抑制了肿瘤生长，与对照组相比。对照组15只小鼠中有12只在21天时肿瘤大小达到2000 mm³，而MCTN-OVA疫苗接种组的小鼠均无肿瘤。先前，通过不同载体（包括质粒DNA、腺病毒和肽疫苗）递送的癌症疫苗在临床前和临床研究中已显示出针对一系列实体瘤的治疗潜力。然而，当使用B16F10模型比较这些系统在抑制肿瘤生长方面的功效时，除基于mRNA的方法外，使用所有这些递送方式在肿瘤植入后第15天都观察到了肿瘤。如前所述，与最先进的脂质复合物系统相比，MCTN表现出优异的脾脏mRNA递送。总之，这些结果表明MCTN可能提供比现有平台更有效的癌症疫苗方式。

2.4 MCTN可以选择性地将有效载荷递送至肿瘤微环境中的MCs

在TME内，诸如TAMs之类的MCs可以诱导免疫抑制并支持肿瘤生长。靶向TME内的MCs提供了一个免疫治疗机会，将TME从免疫抑制的“冷”状态重新调节为“热”状态，其特征是免疫抑制减少、促肿瘤细胞（如TAMs）耗竭以及抗肿瘤效应细胞（如CD8⁺ T细胞）浸润增加。为了证明MCTN可以靶向TME，我们检查了皮下MC38肿瘤负担的C57BL6小鼠中MCTN-荧光素酶的生物分布。MC38同基因模型是一种结直肠肿瘤模型，在TME内表现出大量免疫抑制性MCs。用MCTN-荧光素酶治疗在肿瘤区域内产生比对照组更高的荧光素酶活性。然后，我们使用流式细胞术分析解离的MC38肿瘤，检查了MCTN被TME内MCs的摄取。小鼠通过静脉注射用Alexa Fluor 488标记的mRNA（AF488-mRNA），该mRNA由MCTN封装（MCTN-AF488）或未封装（对照）。这种方法显示，平均而言，MCTN-AF488将mRNA递送至TME内20.5%的MCs（CD45⁺CD11b⁺），而对照组仅为0.89%的MCs。相反，MCTN-AF488仅将mRNA递送至0.93%的非MCs。我们还检查了MCTN靶向TAMs（CD45⁺CD11b⁺CD11c^-Ly6G^-Ly6C^-F4/80⁺）和促炎单核细胞（CD45⁺CD11b⁺CD11c^-Ly6G^-Ly6C⁺）的能力。MCTN-AF488平均分别将mRNA递送至46.7%和27.7%的TAMs和促炎单核细胞。这些结果表明，MCTN可以在全身给药后直接将有效载荷递送至TME，选择性靶向MCs。与局部递送方法（如瘤内注射）相比，静脉注射使用现有的门诊基础设施更易于给药，并且能够靶向原发肿瘤以外的转移部位。

2.5 MCTN-IRF5转染上调抗肿瘤基因同时下调巨噬细胞中的促肿瘤基因

在确定MCTN可以有效转染TME内的MCs后，我们随后通过用编码转录因子IRF5的mRNA转染免疫抑制性BMDMs来检查这种方法的治疗潜力，IRF5抑制肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤免疫抑制活性，同时上调关键的抗肿瘤促炎通路。我们修改了IRF5的氨基酸序列，通过在其C端抑制域内引入磷酸模拟突变（S425D、S427D、S430D和S436D）来产生组成性活性变体，从而改善核转位和整体蛋白质稳定性。使用组成性活性IRF5变体避免了与IRF5激活激酶IKK2共转染以诱导IRF5核转位和功能的需要。

用由MCTN封装的我们的IRF5 mRNA构建体（MCTN-IRF5）转染BMDMs被发现平均增加IRF5表达4.63倍，表明IRF5有效载荷的有效递送。我们的单个mRNA有效载荷诱导的IRF5表达水平与BMDMs共转染野生型IRF5和IKK2时发现的水平一致。这意味着我们可以使用一个而不是两个mRNA有效载荷实现相似的IRF5表达水平。

为了检查MCTN-IRF5处理对巨噬细胞转录组的影响，我们对用MCTN-IRF5和MCTN-荧光素酶转染的小鼠BMDMs进行了RNA-seq分析。我们发现MCTN-IRF5处理降低了与促肿瘤免疫抑制巨噬细胞相关的基因表达，相反增加了与抗肿瘤巨噬细胞相关的基因表达。例如，与促肿瘤免疫抑制反应相关的两个关键基因Arg1和Mrc1的表达被MCTN-IRF5处理下调。相反，与抗肿瘤反应相关的基因表达，如编码促炎细胞因子的Il27和Il12b以及Nos2，被MCTN-IRF5处理上调。观察到的转录组变化表明MCTN-IRF5转染可以将肿瘤巨噬细胞从促肿瘤状态转变为抗肿瘤状态。

2.6 MCTN-IRF5上调T细胞共刺激配体CD80的表面水平和促炎细胞因子的分泌

在确定MCTN-IRF5处理将基因表达的平衡从促肿瘤活动转向抗肿瘤活动后，我们随后检查了这种转变是否具有功能影响。通过检查转染巨噬细胞的免疫表型和细胞因子分泌谱来进行评估。用MCTN-IRF5转染的BMDMs表现出CD80表达增加3.84倍，CD80是一种关键的T细胞共刺激分子，显著高于MCTN-荧光素酶处理。与RNA-seq分析中看到的Il12b表达上调一致，我们发现用MCTN-IRF5转染导致抗肿瘤细胞因子IL12的分泌增加22.4倍。类似地，用MCTN-IRF5转染免疫抑制性huMDM增强了IL12分泌，与荧光素酶对照相比，IL12p70水平高出11.2倍，表明我们的发现可转化为人类巨噬细胞。IL12是一种有效的促炎细胞因子，具有一系列不同的抗肿瘤活性，包括激活和增加T细胞的细胞毒性以及抑制TME内免疫抑制细胞的活性。我们还发现MCTN-IRF5处理使huMDM的促炎性TNF-α分泌提高了9.2倍。这些发现与先前表明IRF5表达上调IL12和TNF-α产生的研究一致。

2.7 MCTN-IRF5处理耗竭免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞，同时增加细胞毒性CD8⁺ T细胞对肿瘤微环境的浸润

为了研究MCTN-IRF5处理对TME组成的影响，我们分析了从同基因MC38结直肠癌模型提取的肿瘤。这些肿瘤收集自用载体和MCTN-IRF5处理的小鼠，并使用流式细胞术进行表征。该分析显示，与载体对照相比，MCTN-IRF5处理组小鼠TME内巨噬细胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-CD170^-F4/80⁺）的平均比例显著较低，分别为MCs（CD45⁺CD11b⁺）的18.5%和31.1%。这种差异反映在免疫抑制性（CD45⁺CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^-CD170^-F4/80⁺MHCII^-CD206⁺）TAMs的下降上，MCTN-IRF5处理小鼠的TAMs平均占MCs的10.2%，而载体对照组为15.4%。我们还观察到MCTN-IRF5处理增加了TME内促炎单核细胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺）的比例，平均占MCs的61.1%，而对照组为47.0%。先前的IRF5疗法已被发现可以增加促炎单核细胞的比例并减少免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞的丰度。

在检查TILs时，我们发现MCTN-IRF5处理小鼠的细胞毒性CD8⁺ T细胞（CD45⁺CD3⁺CD8⁺）平均比例显著更高，占CD45⁺淋巴细胞的42.3%，而对照组为16.7%。CD8⁺ T细胞肿瘤浸润的改善与改善的预后结果相关，表明这些结果具有治疗意义。我们的发现与先前的研究一致，表明IRF5疗法增加了CD8⁺ T细胞肿瘤浸润。我们还观察到MCTN-IRF5处理组的B细胞占TILs的比例较低，平均占TILs的1.25%，而载体组为11.9%。B细胞先前被暗示在MC38肿瘤微环境中具有免疫抑制作用，去除这些细胞抑制了肿瘤生长，表明MCTN-IRF5处理触发的B细胞减少可能影响肿瘤进展。类似地，MCTN-IRF5处理似乎将CD4⁺ T细胞的TIL比例从对照组的17.4%降低到8.23%。先前发现CD4⁺ T细胞耗竭降低了MC38肿瘤的扩张率并改善了对检查点抑制剂疗法的反应性，表明我们观察到的MCTN-IRF5相关的CD4⁺ T细胞耗竭可能具有治疗意义。

我们通过跟踪MC38负担小鼠的肿瘤生长来检查MCTN-IRF5治疗结直肠癌的功效。用MCTN-IRF5处理的小鼠显示出与对照组相比显著的肿瘤生长抑制。这与我们在MCTN-IRF5处理后观察到的TME变化一致，这些变化将TME转向与免疫抑制减少和效应细胞（如CD8⁺ T细胞）浸润增加相关的“热”状态。确实，支持CD8⁺ T细胞在介导MCTN-IRF5肿瘤抑制中的潜在作用，先前发现CD8⁺ T细胞耗竭显著降低了IRF5疗法的抗肿瘤活性。通过将TME从免疫学“冷”状态转变为“热”状态，MCTN-IRF5治疗可以改善免疫系统对肿瘤细胞的识别和排斥。

3 结论

我们开发了一种MCTN，当全身给药时，可选择性地靶向脾脏和TME的MCs，同时避免肝脏靶向。特异性靶向MCs可以显著增强免疫疗法的有效性。例如，这种方法有望开发出更有效的癌症疫苗。mRNA是创建这些疫苗的理想平台，因为它可以精确编程以表达任何感兴趣的抗原。目前，基于mRNA的癌症疫苗，如autogene cevumeran和mRNA-4157，在临床试验中已显示出有希望的结果。例如，在一项1期研究中，16名患有侵袭性胰腺癌的患者中有6名表现出肿瘤特异性T细胞反应，并且在接受autogene cevumeran治疗后36个月内没有癌症复发的迹象。该疫苗使用LPX作为mRNA的载体，证明了这种方法在改善患者 outcomes 方面的潜力。与最先进的LPX系统的直接剂量匹配比较表明，由于优异的有效载荷递送，MCTN可以在低得多的剂量下使用，进一步降低了扩大生产的障碍。与其他依赖甘露糖和/或抗体缀合进行MC靶向的纳米载体不同，这在对缀合物产量和生产成本方面构成挑战，MCTN由肽树枝状大分子、脂质和核酸有效载荷组成，提供了更简单和更可扩展的制造途径。

我们证明了MCTN可用于通过递送编码全长蛋白质抗原而非短表位的mRNA来诱导强烈的抗原特异性T细胞反应，并抑制肿瘤生长。与表位疫苗相比，表位疫苗包含由特定HLA单倍型呈现的目标抗原的小片段，而使用全长抗原的疫苗可用于具有更广泛HLA单倍型范围的患者，因为它们包含了更广泛的可能表位组合。mRNA疫苗相对于其他疫苗方式的其他优势包括作为非病毒载体，避免了与病毒载体相关的潜在安全问题，简化了生产，避免使用昂贵的细胞培养系统，以及可能具有诱导抗原特异性免疫反应和肿瘤排斥的优异功效。

我们通过使用组成性活性形式的促炎性IRF5的全身给药，强调了用MCTN直接靶向TME内的MCs的治疗潜力。在体外，MCTN-IRF5处理下调了巨噬细胞的免疫抑制活性。这在体内治疗中得到了反映，免疫抑制性TAMs和B细胞同时耗竭，同时TME内CD8⁺ T细胞浸润增加。这表明MCTN-IRF5处理将肿瘤从免疫学“冷”表型转变为“热”表型。我们随后证明了MCTN-IRF5治疗抑制了结直肠肿瘤生长。其他研究小组已经探索了通过瘤内注射将RNA直接递送到肿瘤中，证明了抗肿瘤功效。然而，对于位于体内深处的肿瘤或已转移至多个部位的肿瘤，这种方法可能难以实施，因为直接访问更加困难。总的来说，这项研究突出了MCTN作为一种新型免疫疗法，为癌症疫苗递送和TME的直接治疗靶向提供了有效平台。